PCR反应各种问题解答

第第页PCR反应各种问题解答聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是80时代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。PCR反应过程常显现各种问题，下面对问题做认真汇总解答：1.无扩增条带（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保管或运输欠妥而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就快速失活；过低则模板变性不全。（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5—10分钟。（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件欠妥而失活。（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。2.PCR产物量过少（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。（2）DNA模板量太少。加添DNA模板量。（3）PCR循环数不足。加添反应循环数。（4）引物量不足。加添体系中引物含量。（5）延长时间太短。以1kb/分钟的原则设置延长时间。（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净3.扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。（4）模板量过多。质粒DNA的用量应50ng，而基因组DNA则应200ng。（5）引物浓度不足优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。（6）循环次数过多；加添模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延长时间，或改用二种温度的PCR循环。（7）退火温度过低。（8）电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。（9）若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存欠妥引起试剂盒失效；②试剂盒自身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择欠妥。（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。4.扩增产物显现多条带（杂带）（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。（2）循环的次数过多。适当加添模板的量，减少循环次数。（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。（4）退火温度偏低，退火及延长时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延长时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。（5）样品处理欠妥。（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒自身质量有问题。（8）复制提前停止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。（9）反应缓冲液未全溶化或未充分混匀。确保反应缓冲液溶化全并彻di混匀。（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。（12）模板量过多。质粒DNA的用量应50ng，而基因组DNA则应200ng。（13）外源DNA污染。确保操作的干净。5.阴性对照显现条带试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。6.条带大小与理论