生物医药基地western blot技术手册

生物医药基地westernblot技术手册

1.westernblot主要试剂的配方

1.15义电泳缓冲液配方(IL)

Tris-Base15.1g

甘氨酸(Glycine)94g

SDS5g

留意事项：

a.加水时应尽量避开气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至IX使用。

1.2IX转膜液配方［1L)

甘氨酸(Glycine)2.9g

Tris-Base5.8g

SDS0.37g

甲醇200ml

留意事项：

a.参加适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后参加甲醇溶液，最终

用纯水定容至1L(甲醇气味大，通风厨内配制，并留意戴口罩)。

b.加水时应尽量避开气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

1.310XTBS配方UL)

Tris-Base24.2g

NaCl80g

留意事项：

参加适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调整

溶液的PH至7.6(一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调整

PH至7.6即可)。

b.使用PH计调整溶液的PH前，要依据说明书校准PH计。

c.PH调整至7.6后，用纯水定容至1L,使用时稀释10倍至1义使用。

d.配制TBST时，在1XTBS中依据1:1000的比例参加吐温20充分

混匀即可。

1.430%丙烯酰胺单体储存液配方(100ml)

丙烯酰胺(Acrylamide)29g

N,N、・亚甲双丙烯酰胺

(N,N'-MethyleneBisacrylamide)1g

留意事项:

a.将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37C完全溶解，用

纯水定容至100ml。

b.用装0.45|im膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。

c.丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并留意不要造成试验台面

等的污染。

1.5上液(IMTris-HClPH=6.8)配方(50ml)

Tris-Base6.057g

三蒸水40ml

留意事项：用浓盐酸调整PH至6.8,再用三蒸水定容至50ml,4℃冰

箱保存。

1.6下液fIMTris-HCl,pH8.8)[50ml)

Tris-Base9.08g

三蒸水40ml

留意事项：用浓盐酸调整PH至8.8,再用三蒸水定容至50ml,4℃冰

箱保存。

2.WesternBlot主要流程

2.1蛋白样品的提取

2.1.1常用裂解液及其特点

产品编号POO13P00J3BP00I3CP0013DP0013EP0013G

Western及IP

产品名称RIPA裂解液（强）RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）NPT0裂解液SDS裂解液

细胞裂解液

1%NP-40,

1%TritonX-1%TritonX-100,1%1%NP-4O,0.5%

有效裂解成分0.25%!%NP-401%SDS

100deoxycholate,0.1%SDSdeoxycholate,0.1%SDS

deoxycholate

裂解强度温和强中温和温和强

对膜蛋白的提取一般很好较好一般一般很好

对胞浆蛋白的提取很好很好很好很好很好很好

对核蛋白的提取较好很好较好较好较好很好

胞浆磷酸化素门提取很好很好很好很好很好很好

细胞核转录因子提取很好很好很好很好很好很好

含蛋白酶抑制剂是是是是是是

含磷酸酯酶抑制剂是是是是是足

主要用途WB,IP.co-lPWB,IPWB.IPWB,IP,co-IPWB,IP.co-IPWB.ChIP

2.1.2医药基地常用蛋白质提取方法

（1）RIPA强裂解法：

a.取适量胰酶消化细胞［针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），

收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min,尽量去除PBS,向细胞沉

淀中参加适量的预加了蛋白醐抑制剂PMSF的RIPA强裂解液（803

——200ul不等，依据自己细胞量的多少定）。

b.冰上裂解40min,每5min猛烈涡旋一次。

c.充分裂解后，14000rpm,4℃离心15min,将上清转至另一预冷的

EP管中（不要吸到管底的沉淀）。

留意事项：

a.整个过程尽量在冰上操作，由于蛋白在常温降解速度很快，而在

冰上则能显著的减慢这一过程。

b.PMSF有毒，留意戴手套，并留意不要造成试验台面等的污染。

（2）SDS煮沸法（此方法对Caspase家族切割条带具有特效）：

a.收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min,尽量去除PBS。

b.向细胞沉淀中参加适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的SDS裂解

液（80ul—2003不等，依据自己细胞量的多少定）。

c.将EP管放在加热器上95-100℃加热20min以上，加热至样品中的

核酸粘稠物（细胞内核酸）完全溶解为止。

d.充分裂解后，14000rpm,4℃离心15min,将上清转至另一预冷的

EP管中（不要吸到管底的沉淀）。

留意事项：

a.由于加热的温度很高为95℃,煮沸的全过程中，不要离开蛋白样

品，防止EP管炸开而损失蛋白样品，甚至蛋白样品被蒸干。具体技

巧与方法：放物体压住EP管，待加热时间快完毕时，停顿加热，冷

却到肯定时间，轻轻拿开物体，轻轻拿出EP管。

b.尽快将核酸粘稠物煮化，缩短提取蛋白时间。具体技巧与方法：

加热前适度涡旋，加热过程中用剪去尖端的枪头吹打样品。

c.提取的蛋白样品置于・20℃保存。

⑶细胞刮法（针对贴壁细胞）

a.倒掉培育基，PBS洗培育皿2次。

b.吸尽残留的PBS,参加预加了PMSF的SDS裂解液50-500U1,快速

用细胞刮将细胞刮下，并将裂解后的细胞转移到EP管中，其他步骤

同SDS煮沸法。

留意事项：整个过程尽量在冰上操作以减慢蛋白的降解。

2.2蛋白样品的定量

本试验室承受BCA法测定蛋白质浓度，具体步骤:

a.将各蛋白样品稀释20倍（依据自己蛋白样品的浓度可加大稀释倍

数）至总体积为40ul或以上，以供每个样品3个复孔。

b.将蛋白样品和蛋白标准品参加96孔板中，每孔10ul,每个样品3

个复孔。

c.配制显色液，充分混匀，参加96孔板，每孔lOOulo

d.37℃孵育30min,酶标仪检测吸光度。

留意事项：

a.尽量将样品加在96孔板的中间位置，避开酶标仪检测时的边缘效

应。

b.参加样品和显色液的过程中尽量避开气泡的产生。

c.选用准确度高的移液枪，尽量使用进口的枪头。

2.3SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制

2.3.1不同浓度胶的最正确分别范围

SDS-分别胶浓度最正确分别范

6类胶50-150kD

8用胶30-90kD

10%胶20-80kD

|12%胶

12-60kD

15%胶10-40kD

2.3.2不同浓度胶的配制

成分配制不同体积SDS-分别股所需各成分的体积（若升）

_________6%胶5ml10ml15ml201nl30ml50nli

蒸藤水2.04.06.08.012.020.0

30%Acr-Bis(29:l)1.02.03.04.06.010.0

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%过硫酸铉0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04

成分配制不同体积SDS-分别胶所需各成分的体积（圣升）

8%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸饱水1.73.356.710.016.7

30%Aci-Bis(29:l)1.32.74.05.38.013.3

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%过硫酸钺0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03

成分配制不同体枳SDS-分别股所需各成分的体积（毫升）

10%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸徽水1.32.74.05.38.013.3

30%Acr-Bis(29:l)1.73.35.06.710.016.7

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%过疏酸钺0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02

成分配制不同体积SDS-分别股所需各成分的体积（亮升）

12%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸懦水1.02.03.04.06.010.0

30%Acr-Bis(29:l)2.04.06.08.012.020.0

IMTris,pH8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%过硫酸镣0.050.10.150.20.30.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02

成分配制不同体积SDS-分别股所需各成分的体积（宅升）

15%股5ml10ml15ml20ml30ml50ml

蒸馀水0.51.01.52.03.05.0

30%Acr-Bis(29:l)2.55.07.510.015.025.0

IMTris,pll8.81.93.85.77.611.419.0

10%SDS0.050.10.150.20.30.5

10%过硫酸核0.05|0.1|0.150.2I0.30.5

TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02

依据如下表格配制SDS-的浓缩胶(也称为积存胶、上层

胶)

成分配制不同体积SDS-浓缩股所需各成分的体积（定升）

8|10|

5%股2346

5.5|

蒸饰水1.42.12.74.16.8

30%Acr-Bis(29:l)0.330.50.671.01.31.7

IMTris,pH6.80.250.380.5|0.751.01.25

10%SDS0.020.030.040.060.080.1

10%过硫酸筱0.020.030.040.060.080.1

TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01

2.4WesternBlot主要步骤

（1）样品制备（具体方法参见2.1.2）

进展Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin和

GAPDHo

留意事项：一般上样20〜30pg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，

可加大上样量至lOOgg,但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份浓缩

目的蛋白或承受更敏感的检测方法。

（2）电泳分别（参照SDS-电泳方法）

留意事项：

a.胶版都是周密的玻璃器材，使用时轻拿轻放，制止将胶板放到烘

箱烘烤。

b.电泳槽和胶槽中的电泳液要充分，可以避开跑出“笑脸”和“哭

脸'。

C.依据试验者的样品数选择相应的泳道数，样品的两侧需参加蛋白

marker,便于剪切目的蛋白条带。剩余的泳道参加等体积的1XSDS

填充，以平衡盐离子电压，这样可以防止蛋白条带跑歪。两侧的蛋白

marker可选择不同的用量，然后依据蛋白marker的深和浅区分点样

的挨次。

d.WesternBlot中使用过的任何器材、试剂、仪器，全部要放归原位

或恢复到使用前的状态。

（3）转膜

杂交膜的选择是打算Westernblot成败的重要环节°应依据杂交

方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择适宜材质、孔径

和规格的杂交膜。用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜

（NC）和PVDF膜（基地目前使用）。NC膜是蛋白印迹试验的标准固

相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会

与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂

作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。依据被转移的蛋白分子量大

小，选择不同孔径的NC膜。由于随着膜孔径的不断减小，膜对低分

子量蛋白的结合就越结实。通常用0.45摩和0.2即两种规格的NC

膜。大于20kD的蛋白可用0.45pm的膜，小于20kD的蛋白就要用

0.2|im的膜了，如用0.45|xm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。

PVDF膜灵敏度、区分率和蛋白亲和力比常规的膜要高，格外适合于

低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需分别用纯甲醇、纯

水、转膜液浸泡饱和5mino

蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转（基地目前使用）

和半干转移。前者操作简洁，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白

转移，所用缓冲液少。

操作步骤：

a.将胶浸于转移缓冲液中平衡10mino如检测小分子蛋白，可省略此

步，因小分子蛋白简洁集中出胶。

b.依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡lOmino

c.装配转移三明治：海绵+3层滤纸+胶+膜+3层滤纸+海绵，每层放

好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。

d,将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓

冲液，插上电极，选择稳流200mA,l-2h（依据分子量的大小打算电

泳时间）。留意：应再次检查“三明治”和电极是否装配正确，电源

是否接通。

e.转膜完毕后，切断电源，取出杂交膜

留意事项：

a.PVDF膜是比较贵重的试验用品，使用时要节约使用，依据胶的大

小来裁剪PVDF膜。

b.做“三明治”的过程中，膜与胶之间不能有气泡。

c.活化PVDF膜要充分，假设消灭点点白斑，说明活化不充分，需

要延长活化时间。

d,转膜液可回收4次使用，回收次数过多影响试验结果。

e.分子量大的蛋白需延长转膜时间，小分子量蛋白则可适当增加转

膜液中甲醇的比例。

f.转膜完毕后，将膜与胶接触的一面标记为正面。

（4）免疫杂交与显色

a.用25mlTBS洗膜5min,室温，摇动。

b.置膜于25ml封闭缓冲液中lh,室温，摇动。

c.15mlTBS/T洗3次（5min/T）。

d.参加适宜稀释度的一抗，室温孵育l-2h（一抗无法回收）或4℃

过夜（一抗可回收屡次），缓慢摇动。

留意事项：

a.一抗为贵重的试验用品，使用前必读：本试验室有比较齐全和充

分的抗体库，全部（或大局部）购置的抗体在基地OA系统中均有具

体资料记录，首先试验者需要在OA系统中确定基地购置了目的蛋白

相关的抗体，然后确定所购置的抗体的生产商以及货号，再依据这些

信息登陆相应生产商的网页，具体查阅试验者马上使用一抗的用途

（VCB、IP、Flow、IF等）、一抗来源（便于选择适宜的二抗）、目的

条带的分子量大小（便于依据蛋白marker剪切目的条带）、一抗的特

异性、一抗使用的稀释比例。把握这些资料前方能开头下一步的试验。

b