高三一轮复习生物：基因工程和生物技术的安全与伦理问题课件

第33课基因工程和生物技术的安全与伦理第十单元生物技术与工程学业质量水平：1．结合生活或生产实例，举例说出基因工程的基本原理。结合生活或生产实例，举例说出日常生活中的转基因产品。(生命观念)2．运用比较、归纳与概括的方法，理解限制酶和DNA连接酶的作用特点；运用结构与功能观，理解载体的结构特点及作用。运用批判性思维，对转基因技术在应用过程中带来的影响，表明自己的观点并展开讨论。(生命观念、科学思维)3．按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验，写出实验报告并与他人进行必要的交流。(科学思维、科学探究)4．运用演绎与推理、模型与建模，理解基因工程基本操作程序，进行简单的设计。(生命观念、科学思维)5．按照实验操作步骤，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。(科学思维、科学探究)6．结合生活或生产实例，举例说出基因工程的应用和蛋白质工程的基本原理，尝试提出初步的蛋白质工程学构想，进行简单的设计。(生命观念、科学思维)7．运用批判性思维分析生殖性克隆人面临的伦理问题和历史上生物武器对人类造成的严重的威胁与伤害。讨论并对我国不接受任何生殖性克隆人实验和我国反对生物武器及其技术和设备的扩散做出理性解释，培养正确的人生态度和价值观。(社会责任)课标要点一重组DNA技术的基本工具主干梳理1．基因工程分子基因重组构建重组DNA分子表达产物2．重组DNA技术的基本工具细菌核苷酸磷酸二酯键黏性动、植物病毒噬菌体复制起点限制酶的识别序列标记外源DNA3．活动：DNA的粗提取和鉴定(1)活动原理①幼嫩的植物材料如果经过________后再研磨，细胞结构容易被破坏。②用____________________(SDS)处理材料，能使核蛋白________并与___________分离。③乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制_____________活性，防止核DNA被酶解。④DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度______，且Na＋与DNA形成钠盐。冷冻十二烷基硫酸钠变性DNADNA酶高⑤DNA钠盐不溶于________而某些蛋白质能溶于________。⑥在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成________。(2)活动步骤酒精酒精蓝色研磨过滤离心管离心配对加冷酒精白色絮状物◆自我诊断◆判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(

)2．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(

)3．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(

)4．当作载体的质粒DNA分子上至少含一个限制酶切割位点。(

)5．限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种×××√工具酶。(

)6．E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(

)7．可用猪血代替香蕉作为DNA粗提取和鉴定的实验材料。(

)8．在DNA溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热，检测结果呈蓝色。(

)×××√◆精准答题◆如图所示，四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因。(1)将两端用E1切开的tetr基因与用E1切开的质粒X——1混合连接，连接后获得的质粒类型有_____________(填字母，多选)。A．X——1

B．X——2C．X——3D．X——4A、B、C(2)若将上图所示X——1、X——2、X——3、X——4四种质粒导入大肠杆菌(敏感型)，然后分别涂布在含有氨苄青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养基上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有_______________、___________________。(3)如果X——1用E1酶切，产生850对碱基和3550对碱基两种片段，那么质粒X——2(tetr基因的长度为1200对碱基)用E2酶切后的片段长度为_____________对碱基。(4)若将外源的tetr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X——1混合连接，无质粒细胞含X——3的细胞4750并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X——4的细胞数与含X——1的细胞数之比为1∶3，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？________。原因是____________________________________________________。【解析】(1)因目的基因和质粒都是用E1切开且X——1质粒上有两个E1酶切位点，故ampr基因和tetr基因的黏性末端相同，既可能出现ampr基因和X——1连接的产物(X——1)，也可能出现tetr基因和X——1连接的产物(X——2)，还可能出现X——1两端连接形成的产物(X——3)。(2)X——1含有ampr基因，该基因表达后对氨苄青霉素有抗性，X——2含有tetr基因，该基因表达后对四环素有抗性，X——3不含抗性基因，不能DNA连接酶对DNA片段没有选择性(或DNA末端相同)X——4同时含有ampr和tetr基因，ampr和tetr基因表达后，对氨苄青霉素、四环素都有抗性。因此在含有氨苄青霉素或四环素的两种培养基上均不能生长的大肠杆菌中不含X——1、X——2、X——4，即无质粒细胞和含X——3的细胞。(3)若用E1酶切X——1，产生850对碱基的含ampr基因大部分的碱基片段和3550对碱基的含有E2酶切位点的片段，含3550对碱基的片段与tetr基因形成含有4750个碱基对的X——2质粒。用E2酶切割质粒，由环状变为链状，碱基对数不变。(4)含X——4的细胞数与含X——1的细胞数的比值与这两种质粒的数量有关，这两种质粒的形成是通过末端随机结合形成碱基对，再由DNA连接酶连接缺口，而DNA连接酶对该DNA片段无选择作用，故增加DNA连接酶的用量，不改变题中的比值。命题探究命题探究一基因工程的工具分析

1．有关限制性内切核酸酶的易错点(1)限制性内切核酸酶是一类酶而不是一种酶。(2)限制性内切核酸酶作用于磷酸二酯键，而不是氢键。(3)不同种类的限制性内切核酸酶识别的序列与切割的位点不同，这体现了酶的专一性特点。(4)在切割含目的基因的DNA分子时，需在目的基因的两端都用限制性内切核酸酶切割，使目的基因的两端都有可连接的末端。(5)限制性内切核酸酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(6)两个末端若是由同一种限制性内切核酸酶切割产生的，则两片段连接后还具有该种限制性内切核酸酶的识别序列和切割位点。2．限制酶的选择方法(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端或平末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma

Ⅰ会破坏标记基因。3．与DNA有关的四种酶的比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子4.载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，作用机理如图所示：例1[2023·全国卷真题]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(

)A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接【解析】酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和C酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的重组表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。即时巩固某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的被转化，有的未被转化，被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题。(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有____________________________________________________________(答出两点)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是___________________________________________________________；并且________________和含有复制起点、具有标记基因、含有一种或多种限制酶识别序列两者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长含有质粒载体_________________________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。

【解析】(1)质粒能作为基因工程的载体的条件是质粒含有复制起点、具有标记基因、含有一种或多种限制酶识别序列等。(2)用含有氨苄青霉素的培养基对未被转化的大肠杆菌和被转化的三种大肠杆菌进行筛选时，未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)两者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素菌均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长，故两者无法区分；含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长，故两者也无法区分，但前者细胞内还含有四环素抗性基因，而后者细胞内含有的重组质粒在插入目的基因时四环素抗性基因被破坏，因此在含有四环素的固体培养基上前者能生长，后者不能生长。命题探究二DNA的粗提取和鉴定分析

1．DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同项目溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白质NaCl溶液物质的量浓度从2mol/L逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀溶解2.DNA的粗提取与鉴定实验的细节分析实验材料的选取凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核，不能作为实验材料不同实验材料的处理方式若实验材料是植物细胞，加入一定的研磨液，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集滤液；若实验材料是动物细胞(如鸡血细胞)，在其中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可SDS和EDTA在防止DNA降解中的作用SDS是蛋白质变性剂，能使核蛋白变性并与DNA分离；EDTA是离子螯合剂，能结合DNA酶的激活剂——镁离子，能抑制DNA酶的活性提取和分离DNA用塑料离心管的原因细胞破碎后释放出的DNA容易被玻璃容器吸附；由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少选择玻璃棒且搅拌缓慢的原因玻璃棒有吸附DNA的作用，浓缩后的DNA丝状物可以用缓缓搅动玻璃棒的方法卷起；玻璃棒搅拌速度过快，会导致DNA断裂，无法获得完整DNA例2下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(

)A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔，以防DNA断裂C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD．用二苯胺试剂鉴定DNA时需要进行水浴加热A【解析】哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核，细胞内基本不含DNA，故用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量不相近，A错误；DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔，以防止DNA断裂，B正确；DNA不溶于冷酒精，向DNA提取液中加入适量预冷的酒精溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C正确；向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热10min，溶液出现蓝色，D正确。即时巩固[2024·金华一中模拟]从目标生物提取分离DNA，是基因工程操作的基础。下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，错误的是(

)A．95%的冷酒精能除去蛋白质形成含杂质较少的DNAB．沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂，颜色呈蓝色C．香蕉、新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取D．EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解C【解析】DNA粗提取中，使用95%的冷酒精使DNA析出的原理是DNA不溶于95%的冷酒精，因此能除去蛋白质形成含杂质较少的DNA，A正确；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂变蓝，B正确；哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，而香蕉、菜花等植物材料可以用于DNA的粗提取，C错误；DNA酶可以水解DNA，EDTA能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解，D正确。课标要点二基因工程的基本操作程序与DNA片段的扩增及电泳鉴定主干梳理1．基因工程的基本操作程序获取______________、构建__________________、将重组DNA分子导入______________、检测目的基因及其____________等步骤。目的基因重组DNA分子受体细胞表达产物2．原核细胞基因与真核细胞基因结构的异同项目编码蛋白质的核苷酸序列启动子终止子外显子内含子原核细胞连续的有。位于基因的“上游”，有_____________结合的位点，控制_____的开始

有。位于_________，当RNA聚

合

酶到达时，释

放

出RNA产物，转录结束无______真核细胞不连续的有。编码蛋白质的序列有。不能编码蛋白质的序列RNA聚合酶转录基因末端无3.获取目的基因的方法(1)_______________(已知序列)：将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来。此方法成本较高，适于合成序列________的基因。(2)借助载体建立_____________①基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与________组合，导入微生物细胞，形成克隆，基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。②构建cDNA文库的方法：从特定的组织或细胞中提取并纯化全部化学合成法较短基因文库载体__________，然后在____________等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。最后，借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库。(3)聚合酶链式反应技术(__________技术)①特点：简便、________、灵敏。②应用：医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。③模板：_____________________。④原料：4种___________________，即dNTP，N代表A、T、G、C四种mRNA逆转录酶PCR快速待扩增的DNA分子脱氧核苷三磷酸碱基。⑤酶：__________________________。⑥引物：两段很短的单链DNA，分别可以与两条______________复制起始端互补配对成小段双链。⑦过程：包括多次________，每个循环分为3个步骤。变性：模板DNA双链在高温下(90～95℃)________断裂，解旋成2条DNA单链

↓耐高温的TaqDNA聚合酶DNA模板链循环氢键________：温度降低(50～60℃)后，2个引物分别与各自互补的________________结合

↓延伸：分别以两条DNA单链为模板，4种脱氧核苷三磷酸为原料，耐高温的_________________酶在适宜的温度(约72℃)下，以________与模板形成的小段DNA双链区为起点，催化合成一条新的DNA互补链退火DNA单链TaqDNA聚合引物4．利用表达载体构建重组DNA分子(1)____________：用于大量扩增外源DNA的载体。(2)____________：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的________和________信号。(3)用________限制性内切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及____________，然后用______________将它们连接起来，可完成体外重组，形成重组的DNA分子。(4)基因表达载体的组成克隆载体表达载体转录翻译同种表达载体DNA连接酶上游RNA聚合酶转录目的基因末端标记基因5．将重组DNA分子导入受体细胞(1)________________：接受目的基因的细胞。(2)根据受体细胞类型可选择不同的基因导入方法种类微生物细胞动物细胞植物细胞常用方法Ca2＋处理法______________农杆菌转化法受体细胞原核细胞受精卵_____________转化过程Ca2＋处理细胞→___________细胞→________________与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→_____________→受精卵发育→获得具有新性状的动物目的基因插入___________的T——DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达受体细胞显微注射法体细胞感受态重组DNA分子显微注射Ti质粒6.检测目的基因及其表达产物(1)借助载体上的____________可以检测____________是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。(2)利用PCR技术检测①根据目的基因的序列设计PCR________，利用待检DNA为模板进行PCR；②通过________或DNA测序技术鉴定PCR产物。(3)利用核酸分子杂交技术检测标记基因目的基因引物电泳①用化学方法使待检的DNA变性成________并固定在________________上；②加入________，在适当的条件下探针与________的目的基因片段形成双链；③漂洗硝酸纤维素膜去除________结合的探针后，若硝酸纤维素膜仍具有____________或荧光，则可判断待检DNA中含有目的基因；④运用核酸分子杂交技术还可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的____________。单链硝酸纤维素膜探针互补放射性mRNA未互补(4)___________________技术：以目的基因表达出的__________为抗原，制备能与其特异性结合的并能被放射性或荧光标记的________。如果能探测到目的蛋白，则说明目的基因在受体细胞内成功表达。(5)观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定________并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。抗原——抗体杂交蛋白质抗体性状7．活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定(1)实验原理①使用PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，再通过___________________进行鉴定。②使用___________对凝胶进行染色，再用____________以及__________脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。琼脂糖凝胶电泳亚甲基蓝75%酒精蒸馏水(2)实验步骤微量移液器微量离心管底部PCR仪-20电泳缓冲液0.1%亚甲基蓝75%酒精蒸馏水45透明玻璃板加样孔位置长度◆自我诊断◆判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(

)2．检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原——抗体杂交技术。(

)3．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制起点。(

)4．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(

)××××5．PCR实验中使用的微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。(

)6．琼脂糖凝胶电泳法可用于PCR产物的检测。(

)7．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(

)√√×◆精准答题◆草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与植物体内的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)结构相似，可与PEP竞争结合EPSP合酶，阻止PEP转化，影响植物细胞正常代谢。我国科学家从草甘膦施用土壤中的某微生物体内获取GR79基因(草甘膦抗性基因)，并将其导入植物体细胞中获得抗草甘膦的转基因植物。据图回答下列问题。(1)GR79基因发挥抗草甘膦作用的机理可能是_______________________________________________________________。从分离得到的某土壤微生物体内获取含有GR79基因的质粒，并将其保存在某细菌群体(受体菌)中，各个受体菌分别含有该微生物的不同的基因，这些受体菌群中该微生物的所有DNA序列克隆的总汇，称为________________________。(2)据图推测，利用PCR技术扩增GR79基因时，需设计能与该基因两条模板链3′端_________________的引物；同时为构建该基因表达载体，需在引物1和引物2的_____端加上限制酶_________________的识别序列。GR79基因表达的产物阻止(或抑制)草甘膦与PEP竞争结合EPSP合酶基因文库(或基因组文库)碱基互补配对5′PstⅠ和XhoⅠ(3)实验中常采用_______________法将GR79基因表达载体导入植物受体细胞。为避免该基因在近缘农作物中传播，可将其导入植物受体细胞的___________________________________________________________________。除温度、酸碱度等环境因素外，影响该基因导入植物受体细胞成功率的因素有__________________________________________________。(4)为检测GR79基因是否导入植物体细胞，可在培养基中添加____________筛选含该基因的受体细胞；也可利用_______________________________________技术更加精准地进行检测。农杆菌转化

细胞质DNA上(或叶绿体DNA或线粒体DNA或叶绿体和线粒体DNA上)农杆菌的种类和活性、受体细胞的基因型和活性等草甘膦核酸分子杂交(或PCR和核酸分子杂交)若待检DNA中含有该基因，则会发现硝酸纤维素膜上会出现_______________________。(5)经检测，科研人员发现部分获得GR79基因的植物幼苗不具有抗草甘膦的能力，原因可能是______________________________________________。【解析】(1)草甘膦与植物体内的PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)结构相似，会与PEP竞争结合EPSP合酶，影响细胞正常代谢，由此推测，GR79基因表达的产物能阻止(或抑制)草甘膦与PEP竞争结合EPSP合酶，从而发挥放射性或荧光条带GR79基因转录或翻译异常(或GR79基因表达异常)抗草甘膦作用。基因文库能够储存一种生物的全部或者部分基因。(2)据图推测，利用PCR技术扩增GR79基因时，需设计能与该基因两条模板链3′端碱基互补配对的引物。由题图可知，扩增目的基因时，应在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列。由题图中质粒结构可知，限制酶BamHⅠ的识别序列位于标记基因中，不能选用，且为防止目的基因自身环化和反向插入，应选择两种不同的限制酶，即PstⅠ和XhoⅠ，将它们的识别序列分别加在引物1和引物2的5′端。(3)实验中常采用农杆菌转化法将GR79基因表达载体导入植物受体细胞。为避免该基因在近缘农作物中传播，可将其导入植物受体细胞的细胞质DNA上(或叶绿体DNA或线粒体DNA或叶绿体和线粒体DNA上)。除温度、酸碱度等环境因素外，影响该基因导入植物受体细胞成功率的因素有农杆菌的种类和活性、受体细胞的基因型和活性等。(4)为检测GR79基因是否导入植物体细胞，可在培养基中添加草甘膦筛选含该基因的受体细胞；也可利用核酸分子杂交技术(或PCR和核酸分子杂交技术)更加精准地进行检测，若待检DNA中含有该基因，则会发现硝酸纤维素膜上会出现放射性或荧光条带。(5)获得GR79基因的植物幼苗通过基因表达可以表现出抗草甘膦的性状，若不具有抗草甘膦的能力，则意味着草甘膦抗性基因(GR79基因)转录或翻译异常，即草甘膦抗性基因(GR79基因)表达异常。命题探究命题探究一基因工程的基本操作程序分析

1．cDNA文库和基因组文库的主要区别文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子和终止子无有基因中内含子无有(真核生物)无(原核生物)基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因基因获得过程mRNAcDNA→与载体组合→导入微生物细胞→克隆基因组DNA适当大小的DNA片段→与载体组合→导入微生物细胞→克隆2.三种获取目的基因方法的比较项目化学合成法聚合酶链式反应(PCR)建立基因文库法适用对象目的基因序列已知目的基因序列已知目的基因序列未知过程①以单个脱氧核苷酸为原料按照已知DNA序列直接人工合成②逆转录法：获取mRNA→合成DNA单链→合成DNA双链(目的基因)在体外通过酶促反应有选择地大量扩增特定的DNA片段，即目的基因利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶、质粒等工具建立基因文库→筛选出目的基因优缺点专一性强，获取的目的基因较少速度快，以指数方式扩增操作相对简便，但工作量大3.利用双酶切法构建重组DNA分子双酶切法是指用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割载体和含有目的基因的DNA分子，以构建重组DNA分子。由图示可知，质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端1与2，目的基因所在的DNA分子经BamHⅠ和EcoRⅠ切割后，分别形成黏性末端3与4。双酶切法的优点：①可避免载体和目的基因的自身环化(1与2不互补、3与4也不互补)；②可避免载体与目的基因的反向连接(1只与3互补，2只与4互补)。4．受体细胞拓展(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌更有优势。(4)受体细胞的特点：能处于一种状态，便于重组DNA分子导入；一般无标记基因；缺乏限制性内切核酸酶，防止重组DNA分子被降解，使其在受体细胞中稳定存在。提供Ti质粒的农杆菌与用于转化的农杆菌受体细胞比较：用于转化的农杆菌应为敏感菌和限制性内切核酸酶缺陷型。5．筛选含有目的基因的受体细胞(1)DNA杂交鉴定：如从受体细胞中提取DNA分子，并合成与目的基因序列互补的探针(基因探针就是用放射性同位素或荧光分子标记的含目的基因的单链DNA片段)，进行核酸分子杂交(如图)。(2)鉴定该DNA分子中是否有目的基因，用限制性内切核酸酶进行酶切，做酶切图谱鉴定。(3)利用重组质粒上的抗性基因、显色反应、噬菌斑、营养缺陷型等进行鉴定。如以下案例：①原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。②被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。③筛选方法：将转化后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图，其中能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，即图中的1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。6．目的基因是否表达的检测方法(1)使用“目的基因”作探针，运用核酸分子杂交技术检测目的基因是否转录出特定mRNA。(2)采用“抗原——抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。(3)采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因是否成功表达的“个体生物学”水平的检测。例1[2023·湖北真题]用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(

)A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落D【解析】若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确。DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，因此DNA凝胶电泳技术能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确。SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。即时巩固1．PCR可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏，快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量，利用Cas12a检测靶标DNA的过程如下图所示。回答下列问题。(1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，具有类似________酶和________酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是___________________原则。(2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入lacZ基因内，使lacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，ampr为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌，判断的依据是_____________________________________________________________限制解旋碱基互补配对使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底________________________________________________________________________________。(3)荧光检测时，60min后三组荧光信号强度达到一致，原因是______________________________________________________。(4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是_______________________________________________________；g——3＋g——7组可更快检测出靶标DNA，原因是______________________________________________________________________________。物的对应培养基上培养长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光 g——3＋g——7组在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用【解析】(1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，可以切割靶标DNA，并能解开靶标DNA双链，使其与g——3和g——7结合，所以Cas12a具有类似限制酶和解旋酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是碱基互补配对原则。(2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入lacZ基因内，使lacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，而使用的培养基中不含无色底物，所以在含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基上培养长出的菌落，无论Cas12a基因是否成功导入都不会出现显色反应。(3)荧光检测时，60min后三组荧光信号强度达到一致，原因是Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光的物质含量相同。(4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是排除其他物质介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光；g——3＋g——7组可更快检测出靶标DNA，原因是g——3＋g——7组在介导Cas12a蛋白切割荧光底物使其发出荧光方面具有协同作用。2．[2024·萧山中学模拟]枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌)，从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。(1)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列相同，这是因为_________________________________________________________。(2)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是_________________________________。酶切后的C1酶基因需要在_____________酶的作用下与HT质粒连接构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、复制起点、_____________、____________等。BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换)DNA连接目的基因标记基因(3)转化形成工程菌的过程中，应先用___________处理枯草芽孢杆菌，使其处于容易吸收周围DNA的状态。(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。图2结果说明工程菌降解纤维素的能力最强，推测对照组2的处理应为_________________。CaCl2接种(等量)B菌(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用：__________________________________________________________(举一例)。【解析】(1)对克隆得到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白质的氨基酸序列相同，这是因为密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸。(2)C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是BamHⅠ、SmaⅠ。酶切后的C1酶基因降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染；处理绿色废弃物需要在DNA连接酶的作用下与HT质粒连接构建基因表达载体。一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、复制起点、目的基因、标记基因等。(3)枯草芽孢杆菌应先用Ca2＋处理，使其处于能吸收周围DNA的感受态状态，有利于转化形成工程菌。(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2向培养基中接种(等量)B菌。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果接种工程菌的一组培养基中纤维素含量最低，说明工程菌降解纤维素的能力最强。(5)工程菌具有很强的降解纤维素的能力，因此该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用是降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。命题探究二PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定分析

例2[2023·浙江6月选考真题]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3——GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是(

)A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3——GFP基因纯合子D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子【解析】分析题图可知，启动子在左侧，GFP基因整合到Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子B能控制GFP基因的表达，A错误；因为启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3——GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好地区分杂合子和纯合子，D错误。即时巩固[2024·台州模拟]人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是___________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是__________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程具体需要_____种酶，它们分别是________________________________________________________________________________________。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原SalⅠEcoRⅠ6 TaqDNA聚合酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶因是_______________________________________________________。(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，F7与R扩增产物的受体细胞不再有荧光。若基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于_______________________________________________，理由是________________________________________________________________________________________________________________________引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达

根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物_____________________________________________________________________________________________________________________________。【解析】(1)由题图可知，荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，则扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而荧光蛋白基因的右侧有3个限制酶切点，分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切点，但因为用EcoRⅠ酶切会破坏荧光蛋白基因，所以只能用Mun

Ⅰ和XhoⅠ限制酶切割，扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段，并能与左侧的荧光蛋白基因片段和

上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上右侧的P片段连接起来。由于F1～F7中有XhoⅠ限制酶切割位点，所以需寻找能代替XhoⅠ限制酶，且切割后的产物能与XhoⅠ限制酶切割后的产物连接的限制酶，而SalⅠ限制酶就符合这一要求，所以在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；而调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点，所以需寻找能代替MunⅠ限制酶，且切割后的产物能与MunⅠ限制酶切割后的产物连接的限制酶，而EcoRⅠ限制酶就符合这一要求，所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要TaqDNA聚合酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ和DNA连接酶，共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，说明F1～F6与R扩增产物含完整的启动子，荧光蛋白基因表达；含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，说明F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不能表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，雌激素能诱导启动子发挥作用。构建的载体含有BCL11A基因，导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，说明F1～F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子，荧光蛋白基因不表达)，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，说明F5～F6与R扩增产物上均无结合位点(启动子完整，荧光蛋白基因能表达)，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。课标要点三基因工程的应用与蛋白质工程主干梳理1．基因工程改善了人类的生活品质缺陷基因正常功能的基因生物反应器电泳2．蛋白质工程是基因工程的延伸基因蛋白质氨基酸核苷酸核苷酸丝氨酸3．以测序为基础建立的基因数据库是人类共有的财富(1)2003年____________________测序完成，我国也参与其中并做出很大的贡献。(2)基因测序技术不断发展，不仅________越来越快，而且________也越来越低。(3)多个国家和机构建立了庞大的___________________。①数据库信息不仅通过互联网共享，还定期交换数据进行更新。②现在通过访问___________，任何人都可以方便地检索出需要的信息。人类基因组计划速度成本生物信息数据库互联网③科学家也能通过比对________或__________的序列重新审视生命进化的历程，深度解码个人的_____________。核酸蛋白质遗传信息◆自我诊断◆判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(

)2．蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(

)3．蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。(

)4．利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(

)×√√×◆精准答题◆[2023·湖南真题]基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5——甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷(NTDs)相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题。(1)此家系先天性耳聋的遗传方式是_______________________。Ⅰ——1和Ⅰ——2生育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是_________。(2)此家系中甲基因突变如下图所示：正常基因单链片段5′——ATTCCAGATC……(293个碱基)……CCATGCCCAG——3′突变基因单链片段5′——ATTCCATATC……(293个碱基)……CCATGCCCAG——3′研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶(识别序列及切割位常染色体隐性遗传病1/32点为)酶切，检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′——GGCATG——3′，另一条引物为_________________________(写出6个碱基即可)。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ——1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为________________bp(注：该酶切位点在目的基因片段中唯一)。(3)女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4～1.0mg·d－1，NTDs生育史女性补充4mg·d－1。经基因检测胎儿(Ⅲ——2)的5′——ATTCCA——3′8、302和310乙基因型为－/－，据此推荐该孕妇(Ⅱ——1)叶酸补充剂量为_____mg·d－1。【解析】(1)由遗传系谱图可知，由于Ⅰ——1与Ⅰ——2均表现正常，他们关于甲病的基因型均为＋/－，而他们的女儿Ⅱ－4患病，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传病。由Ⅰ——1、Ⅰ——2和Ⅱ——3关于乙病的基因可以推出乙基因突变导致的遗传病也是常染色体隐性遗传病，所以Ⅰ——1和Ⅰ——2生出一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2＝1/32。(2)研究甲基因突变的情况，Ⅱ——1为杂合子，兼有正常甲基因和突变4甲基因。已知设计了一条引物为5′——GGCATG——3′，与给出的甲基因(或甲突变基因)单链片段的3′端互补，则另一条引物应与给出的甲基因(或甲突变基因)单链片段的互补链的3′端互补，即可以为5′——ATTCCA——3′。可扩增出大量正常甲基因和突变甲基因供后续鉴定。此时酶切，正常甲基因酶切后片段长度分别为8bp和302bp(2bp＋293bp＋7bp)，突变甲基因没有识别序列，无法被酶切，其片段长度为310bp。(3)Ⅲ——2关于乙的基因型为－/－，有患NTDs的可能，因此推荐该孕妇(Ⅱ——1)叶酸补充剂量为4mg·d－1。命题探究命题探究一基因工程的应用

例1[2024·宁波效实中学模拟]回答下列关于转基因技术应用的问题。(1)将山核桃miRNA169基因转入拟南芥中，可促进拟南芥提前开花。提取山核桃根、茎、叶、雌花和果实中的RNA，经___________形成cDNA，再利用PCR技术________并扩增出大量miRNA169基因，用双酶切法将miRNA169基因连接至表达载体，通过农杆菌转化法转入拟南芥愈伤组织细胞中，然后利用转化细胞的________性，在含有抗生素和逆转录筛选全能_______________________________的MS培养基中经分裂、分化、器官发生和形态建成，获得转基因拟南芥。(2)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如下图所示。植物生长调节物质(或植物激素)步骤①中需要使用的工具酶有________________________________。步骤②和③所代表的操作分别是____________和_________________。步骤④通常需用特定激素处理代孕母体，以使其_________________________________。与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器获得W的优势在于不受转基因动物的年龄、性别以及_______________________________等的限制。(3)为培育能分泌酸性纤维素酶的乳酸菌，将乳酸菌与含酸性纤维素酶基因的重组质粒共培养，加入__________________以增大乳酸菌细胞膜的通透性，便于乳酸菌发生转化。转化的效率与乳酸菌的密度和生长状态、限制性内切核酸酶与DNA连接酶显微注射胚胎体外培养同期发情(或处于相同生理状态)是否处于生殖期(或生长时期)氯化钙(或Ca2＋)__________________、无菌条件、无氧条件等密切相关。将处理后的培养物进行梯度稀释后接种至以__________为唯一碳源的平板培养基中筛选出成功转化的乳酸菌，再采用________(填“静置”或“振荡”)培养法扩大培养。【解析】(1)提取得到的RNA，经过逆转录可以形成cDNA，但因为提取得到的RNA有多种，所以经逆转录形成的cDNA也有多种，可以通过PCR技术按照碱基互补配对原则筛选出特定的基因片段并进行扩增。利用转化细胞的全能性，在MS培养基中添加抗生素和植物生长调节物质，除去农杆菌，诱导愈伤组织的分裂、分化。(2)形成重组表达载体的工具重组质粒的浓度纤维素静置酶是限制性内切核酸酶与DNA连接酶。步骤②将重组表达载体导入受精卵，需用到显微注射技术，步骤③为受精卵发育成早期胚胎，需经过胚胎体外培养，步骤④将早期胚胎移植入代孕母体，为保证移植胚胎的正常生长发育，需用特定激素处理代孕母体，使其处于同期发情状态。膀胱生物反应器不受生殖期的限制，不同发育阶段都能获得产物。(3)将重组质粒导入乳酸菌时，可用氯化钙处理细菌以增大细菌细胞膜的通透性，提高转化成功率。转化效率还与乳酸菌的密度和生长状态、重组质粒的浓度、无菌条件、无氧条件等密切相关。将处理后的培养物进行梯度稀释后接种至以纤维素为唯一碳源的平板培养基中进行筛选。实验室中大规模培养微生物所用的培养基一般为液体培养基，乳酸菌为厌氧菌，故采用静置培养法扩大培养。即时巩固基因定点整合可替换特定基因，该技术可用于单基因遗传病的治疗。苯丙酮尿症是由某基因(A)突变引起的，将正常A基因定点整合到A基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，可用来研究该病的基因治疗过程。基因定点整合的过程如图所示，已知neor基因可作为标记基因，含有neor的细胞具有对G418的抗性。回答下列问题。(1)构建重组载体，常用的工具酶有______________________。构建重组载体时，需要大量A基因，常用_________技术合成A基因，利用该方法合成A基因时需要设计并合成______种引物。(2)将重组载体导入患病小鼠胚胎干细胞的常用方法为______________。检测患病小鼠胚胎干细胞中是否导入重组载体的方法是在含有________的培养液中培养胚胎干细胞。(3)用图中重组载体转化胚胎干细胞时，会出现A基因错误整合。错误整合时，重组载体上的两个HSV——tk至少会有一个与neor一起整合到染色体DNA上。已知HSV——tk1、HSV——tk2的产物都把DHPG转化成限制酶和DNA连接酶PCR两显微注射法G418有毒物质而使细胞死亡。将导入重组载体的胚胎干细胞置于同时含有G418和DHPG的培养液中培养，存活下来的是_____________(填“正确整合”或“错误整合”)的胚胎干细胞，理由是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)将上述筛选得到的胚胎干细胞培育成转基因小鼠，还需要____________________________(答出两点)技术。【解析】(1)构建重组载体时，需要使用的工具酶为限制酶和DNA连接酶。正确整合

能在含有G418的培养液中存活，说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在含DHPG的培养液中存活，说明转化后的胚胎干细胞中不含有HSV——tk胚胎体外培养、胚胎移植大量制备A基因，即特定基因的扩增，常用PCR技术，利用PCR技术扩增基因时需要合成基因两侧的两种不同的引物。(2)由题意可知，小鼠胚胎干细胞为受体细胞，培育转基因动物时将重组载体导入受体细胞的常用方法为显微注射法。由题意可知，neor为标记基因，结合题中该基因的作用可知，欲筛选含有重组载体的小鼠胚胎干细胞，应将处理后的胚胎干细胞放在含有G418的培养液中进行培养，存活下来的即为导入重组载体的胚胎干细胞。(3)由题意可知，含有neor基因的细胞具有对G418的抗性，能在含G418的培养液中存活，说明转化后的胚胎干细胞中含neor基因。HSV——tk1、HSV——tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡，故能在含DHPG的培养液中存活，说明转化后的胚胎干细胞中不含HSV——tk，则在含有G418和DHPG的培养液中能存活的胚胎干细胞中含neor基因，而不含HSV——tk，即发生正确整合的胚胎干细胞。(4)将正确整合的胚胎干细胞培育成小鼠，还需借助胚胎工程相关操作，如胚胎体外培养、胚胎移植等技术。命题探究二蛋白质工程

蛋白质工程与基因工程的关系项目蛋白质工程基因工程区别操作过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→逆推出基因的脱氧核苷酸序列并改造→将改造的基因导入受体细胞并表达获