3.2基因工程的基本操作程序的课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序学习目标与任务1.阐述基因表达载体构建的意义；2.说出基因表达载体的结构组成以及各元件的作用；3.辨析启动子和起始密码子、终止子和终止密码子；4.阐述基因表达载体的构建过程。问题探讨苏云金杆菌培育转基因抗虫棉需要哪几步？Bt基因表达苏云金伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）摄食害虫死亡苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程问题探讨1.基因:具有遗传效应的DNA片段2.目的基因定义：主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子。如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因第一步、目的基因的筛选和获取那么如何筛选合适的目的基因呢？目的基因的筛选和获取棉花植株(有抗虫特性)转入Bt抗虫蛋白基因3.目的基因的筛选目的基因的筛选和获取3.目的基因的筛选明确了目的基因后，该怎样获取它呢？多聚酶链式反应（简称PCR），在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。PCR扩增仪目的基因的筛选和获取3.利用PCR获取和扩增目的基因复习：DNA在细胞内复制所需要的条件条件名称模板双链DNA分子原料4种脱氧核苷酸能量ATP酶DNA解旋酶DNA聚合酶PCR的原理——体外DNA复制多次重复PCR所需要的条件条件名称模板双链DNA分子原料4种脱氧核苷酸能量加热酶DNA聚合酶引物2种?热稳定的指数形式2n

扩增（n为扩增循环的次数）

1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要（24-1）×2=30个引物2×（2n-1）PCR技术扩增目的基因过程：PCR技术扩增目的基因过程：PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成归纳比较获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用这就是需要构建基因表达载体。这也是培育转基因抗虫棉的核心工作那么基因表达载体是由哪些部分组成的呢？第二步：基因表达载体的构建不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。

获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？（核心工作）思考：各个元件有什么作用？

因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。第二步：基因表达载体的构建目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选。第二步：基因表达载体的构建第二步：基因表达载体的构建

如何构建抗虫棉的基因表达载体？①

用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②

用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有Bt基因的DNA片段。③

将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。第二步：基因表达载体的构建同一限制酶切割获得的目的基因和载体混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有（仅考虑两两连接）切割质粒和含目的基因的DNA片段的限制酶一般是同一种酶，也可以是不同限制酶，只要获得能互补的末端即可。但有时可用两种限制酶同时切割质粒和含目的基因的DNA片段，这样可保证目的基因和质粒的定向连接，防止目的基因和质粒的自我环化。第三步、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞(1)花粉管通道法①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊(2)农杆菌转化法①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程②农杆菌的特点：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T­DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上Ti质粒T­DNA目的基因植物细胞表现出新性状的植株将目的基因插入染色体DNA中含重组Ti质粒的农杆菌构建表达载体转入农杆菌导入植物细胞③农杆菌转化法过程第三步：将目的基因导入受体细胞2.将目的基因导入动物细胞(1)方法：显微注射技术(2)受体细胞：受精卵3.将目的基因导入微生物细胞常以大肠杆菌作为受体细胞，一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中第三步：将目的基因导入受体细胞种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法；花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子第三步：将目的基因导入受体细胞第四步、目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质——“抗原—抗体杂交技术”2.个体生物学水平鉴定1.分子水平检测抗性检测：功能活性比较：PCR技术

或分子杂交技术抗虫、抗病接种实验；基因工程产品与天然产品的功能活性比较——检测是否具有抗性以及抗性强度等方法如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR扩增转基因生物提取DNADNA作为模板PCR操作M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果DNA半保留复制原理：目的基因的检测与鉴定是否扩增出目的基因以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）电泳操作

引物如何设定？原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。目的基因的检测与鉴定①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因酶切转膜标记的DNA/RNA探针DNA分子杂交（Southern-blot)流程图以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）方法2：

DNA分子杂交技术碱基互补配对原理：②检测目的基因是否转录出了mRNA方法：PCR扩增或分子杂交技术转基因生物提取RNARNA作为模板PCR操作电泳是否扩增出目的基因逆转录cDNA目的基因的检测与鉴定提取RNA转膜标记的DNA/RNA探针RNARNA分子杂交(NorthernBlot)流程图以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：

抗原与抗体的特异性结合原理：苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物目的基因的检测与鉴定放射性检测

（杂交带）以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带抗原—抗体杂交技术2.个体生物学水平鉴定没有抗虫基因的棉花植株有抗虫基因的棉花植株棉铃虫没有死亡棉铃虫死亡接种棉铃虫目的基因的检测与鉴定以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）转Bt基因非转基因1、下列关于基因工程的叙述，正确的是（）A.基因工程是细胞水平上的生物工程B.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因C.基因工程成功的原因之一是所有生物共用一套遗传密码D.基因工程的产物对人类都是有益的练习C练习2、以下为逆转录过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法错误的是(

)A.催化①过程的酶是逆转录酶B.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合C.催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%D3、科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：（1）PCR过程所依据的原理是_______________，该过程需要加入的酶是_______________________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______________。（2）该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是______________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是______________________________