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DB34DB34/T1891—2013活毒疫苗中禽白血病病毒污染检测技术规程DiagnosticTechnologySpecificationonAvianLeukosisVirusContaminationofLiveAttenuatedVaccine安徽省质量技术监督局发布I鸡白血病是由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒（ALV）引起的鸡的传染性肿瘤疾病，重，活毒疫苗的污染是引起传播的重要因素，检测活毒疫苗中ALV的污染对防控鸡白血病具有重要意1NY/T680-2003禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法50羽份。取100ul稀释液进行ELI4检测方法4.1酶联免疫吸附试验（ELISA按NY/T680-2003的要求进行，试验成立条件略注：也可选择市售商品化p27抗原ELTaq酶、dNTP、DNAMarker、琼脂糖、细胞裂解液、酚、氯仿、异戊醇、ddH2O、7），2c)加入等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1),室温振荡5min，静置5min。4℃,12000rpm离分钟，让乙醇挥发干净。加入20～302211DNA模版2注：根据禽白血病病毒各亚群pol基因序列相对保守的特点，在其保守区内设计1对引物5’-CTAACGAGGCGAGGGAATG-3’，下游5’-TTGGTGGGTTGGGTGGAGA-3’，扩增泳液直至淹没凝胶。取6μL～8μLPCR扩增产物与1μL～2μ3在其中一孔内加入与样品相同体积的DNAMarker,在电压80V～100V或在电流40mA～50mA电泳电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。阳性对照在214b条带，而阴性对照无任何条带则实验成立。若被检样品在214bp处有明显条带，可判为阳性；否则为阴性，见图1。bp250图1禽白血病病毒(ALV)P27抗原PCR阳性参考图M:Marker;1:阴性对照；2～6:阳性条带。4称取1MTris溶液160ml用分析纯A.6细胞裂解液的配制A.750×TAE缓冲液（贮存液）配制Tris碱242g，冰醋酸57.0mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL搅拌溶解后，用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1000mL，常温保持备用。A.81×TE缓冲溶液的配置5ml

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