中图版高中生物考点加强课6限制酶的选择原则

考点加强课6限制酶的选择与口的基因的检测

为藤•练~与鉴定

I展现肆方法|技法必备巧攻关

1.限制酶的选择原则

Pst

PstISmaIPsiI

L+

sLI抗病法国京RI

图中

(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因"切出"，如图甲可选择

PstT。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择

Smal„

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基

因和质粒，如图甲也可选择用PstI和EcoRI两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶

的切点)，而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类

因其切点

不在启动;

其会破坏启动子不

子与终止M〃din—一宜选择

子之间不

宜选择其位『启动子、终

，抗性赳终止天'BamH1止子之间宜选择

■EcoRI

因其位于其会破坏终止子不

“标记基因宜选择

内不宜选

此位点切割会导致

择“

终止子丢失不宜选

因其位于或制原点内.如制原点被破坏或择

切掉后不能在受体细胞中或制保存.而不

宜选择

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，

应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶夕stI因其会破坏标记基因而不宜选择。

③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一

个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片

段进入受体细胞后不能自主复制。

④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中》〃7din会破坏启动子,

FcoRI会破坏终止子，而A/del和BarriaI切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止

子之间。

(3)参考Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶

若质粒上标出T-DNA片段，则所选限制酶切点应位于T-DNA片段中，从而有利

于将目的基因嵌入到T-DNA片段上——因为Ti质粒的T-DNA片段最易转移至受体细

胞并且整合到受体细胞染色体DNA上,如用两种限制酶XbaI和SacI(两种酶切出的

黏性末端不同)切割某DNA,获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，

则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。(分析如下)

T-DNAT-DNAXbaISacIXbalXba\

切点不位于上而且含XbaI,T-DNA上

T-DNA上SacI两种切点恰但缺乏Sac\

与目的基因两端切点

切点相同

2.目的基因的检测与鉴定

(1)界定〃标记基因〃与〃DNA分子杂交技术〃在目的基因检测中的作用：

①载体上标记基因的标记原理

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵

抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细

胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生

素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，

当然不会有〃目的基因〃转入，能存活时必含该载体,原理如下图所示：

进入受_________在含南城节青尊隶I

的培养基上培养

只有含有载体.

含有氨节育

IQI并且载体上的

大肠杆菌中有的

霉素抗性基基因表达的大

因的质粒有载体进入,有

肠杆菌才能存

的没有载体进入

活井增殖

②"标记基因"筛选后为何还需应用"DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转

入？

经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是

否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用"目的基因"作探针，利用DNA分子

杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。

(2)使用"目的基因"作探针，运用"分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定

mRNA。

(3)采用"抗原一抗体杂交技术"，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与相应抗体杂

交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否"指导"特定蛋白质的合成。

(4)采用抗虫、抗病毒等"接种实验”进行目的基因成功表达的"个体生物学"水平的

检测。

|探高考真题|探究高考明考百

【例证】(2016•全国卷IH,40)图⑻中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、

8amHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示

意图(载体上的EcoRI、Sa=3AI的切点是唯一的)。

—GAATTCGGATCC—GATC

——Cl'TAAGCCTAGG——CTAG

,Sau3AI

抗生素抗性基因

图(b)

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

(1)经BarriaI酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物

连接，理由是__________________________________________________

(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA

分子，如图(c)所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的

有,不能表达的原因是

目的H的基因

基因

目的

基因

图(C)

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其

中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_______________________O

［慧眼识图获取信息］

(1)三种限制酶切割结果分析

&„RI切割后的黏性末端I切割后的新性末端

-GAATTC——G{GATC}C—

—errAAG——CCTAG—A"G一

3AI切割后的黏性末端

GATC—

Tta®-此两类黏性末端

▲可相互.配对”

..............一故可连接

(2)表达载体与重组DNA分子分析

由此可见,只有乙所示目的基因其首端为

启动于.尾端燧止于，故其能正常表达

答案(l)Sa=3Al两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中

目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不

能被转录(3)£co//DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶

|练经典模拟|技法体验志必得

1.（2019•湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验

流程。所用的PBR322质粒含有限制酶PstI、EcoRI和HindHI的切点各一个，且三种

酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨莘青霉素抗性基因，TeV表示四环素抗性基

因。请回答以下相关问题：

构建基因表二大

一达载体肠

杆

赭

无菌牙签

含四

坏素

切割后的啦粒人

生

培养.分离纯化

代

丙激

人生长激素

素基因（器器台01僦

三人生长激凝mRNA」一人的某组织细胞

（1）过程①所用到的组织细胞是,过程④所用的酶是o⑤过程常用

溶液处理大肠杆菌。

（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为。

（3）如果用限制酶R?I、£coRI和477dHI对图中质粒进行切割，用一种酶、两种

酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA

片段种类（填"相同"或"不同"），这些种类的DNA片段中含有完整氨节青霉素

抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有种和种。

（4）如果只用限制酶PstI切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含

Amp、TeV）,将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培

养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的

生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选的大肠杆菌;

接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是.含有

目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

（5）将大肠杆菌培养在含氨茉青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作

中的___________________________________________________

步骤。该基因工程中的PBR322质粒彻底水解的产物是___________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

解析（1）过程①获得的是人生长激素mRNA,所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过

程④构建基因表达载体的酶是DNA连接酶；过程⑤将基因表达载体导入大肠杆菌前，常

用CaCL溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。（2）②过程是人的生长素mRNA逆转

录形成cDNA的过程。（3）为？1、Ecc^I和/■/力dm三种酶的切点分别用1、2、3表示，

一种酶酶切时，一共可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得至I」1-2,2-1,

2-3,3-2,1-3,3-1六种片段;三种酶酶切时,可得到1-2,2-3,3-1三种片

段，与前面重复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用

一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类相同。这些种类的DNA片段中含有完整

氨萃青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。（4）

在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生长的

是具有四环素和氨莘青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的PBR322质粒或含有Amp1

Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠

杆菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨莘青霉素抗性基因，使含

有目的基因的大肠杆菌不能在含有氨茉青霉素的乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完

好的，则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长。（5）将大肠杆菌培养

在含氨莘青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞

步骤。该基因工程中的pBR322质粒的化学本质是DNA,其彻底水解的产物是磷酸、脱

氧核糖和四种含氮碱基。

答案（1）人垂体组织细胞DNA连接酶CaCI2

（2）cDNA⑶相同33⑷含四环素抗性基因完整的pBR322质粒（或含有

Amp'Tetr的质粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）筛选含目的基因的受体细胞磷

酸、脱氧核糖、四种含氮碱基

2.（2019•河南名校联盟调研）如图所示为培育转基因细菌的操作流程，回答下列问题：

◎+1细菌在培养液中

繁殖后,在固体

培养基生长建一

我体外源DNA-重。制质粒

转染

—市组DNA增殖筛选含重组

细菌咬粒的细菌

2

（1）图中①过程所用工具酶有o为了防止载体和外源DNA自连，应

如何操作?.

(2)当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时，该转化过程又称转染。图

中外源DNA来自。为了提高转染效率，应使用处理细菌。

⑶图中②过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？

_______________________________________________________O

(4)图中③过程，筛选含重组质粒的细菌需用到基因的功能。已知所用载体内

有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素的培养基上生长，

但不能在含青霉素的培养基上生长的细菌即为含外源DNA细菌的前提条件：

_________________________________________________(答出两点即可)。

解析根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源DNA应来自(DNA)病毒。

另外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。

答案Q)限制酶和DNA连接酶应使用两种限制酶同时切割载体和外源DNA

(2)(DNA)病毒Ca2+

(3)模板、原料、酶和能量等

(4)标记原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源DNA插入到载体的青霉素

抗性基因内部

课后•加强训练

（时间：15分钟）

1.（2016•全国卷I,40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tet「中会

导致相应的基因失活（Ampr表示氨茉青霉素抗性基因，Tet「表示四环素抗性基因）。有人将

此质粒载体用BamHI酶切后,与用8a6HI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接

酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的

被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入

了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

启动于

⑴质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有

（答出两点即可）,而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和

终止子。

（2）如果用含有氨萃青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化

的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是

并且和的细胞也是不能区分的，其原因是

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,

还需使用含有的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于

解析（1）作为运载体必须具备如下特点：①能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；

②含标记基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；③具一个至多个限制酶切割位点以便外源

DNA插入。（2）在含有氨莘青霉素的培养基上,只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。

而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr,不

能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均

具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的TeV,故含有插入

了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载

体的大肠杆菌得以区分。（3）噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA,需借助宿

主细胞完成DNA复制。

答案Q）能自我复制、具有标记基因

（2）二者均不含有氨节青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有

插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）二者均含有氨芋青霉素抗性基因，在该

培养基上均能生长四环素

（3）受体细胞

2.（2019・湖北武汉市调研）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从

乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经

历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用

高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风

险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中后cZ基因可使细菌利用

培养基中的物质X-gal,从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列

问题：

BtimHI

青毒素

基因|导入,厮杆菌日|乙肝病即外壳|

抗性基因/"'Z

粒|I注射?按种

BamHI目的BamHI/®l

匚您“I/

IH加抗体I

EroRVEcoRI

（1）过程①最好选用的限制酶方案可以是,

A.&TJRV和6a/77HIB.Ba/nHI和&'oRI

C.FcoRV和EcoRID.只用88mHI

⑵由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是

⑶若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是

（写中文全称）。图中过程②常需要用处理，使大肠杆菌细胞转化为感受态细胞。

（4）为了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加

入,培养一段时间挑选出呈（填"蓝色"或"白色"）的菌落进一步

培养获得大量目的菌。

（5）用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因

解析Q）分析题意可知，切割目的基因和运载体应用相同的限制酶，所用限制酶要保

证目的基因的完整性，并且把目的基因插入质粒中，故选用BamHI和EcoRI（用一种限

制酶切割时，目的基因和运载体可能会发生自身环化或随意连接）。（2）从过程③可知，目的

基因在大肠杆菌体内可表达出乙肝病毒外壳，故该目的基因的功能是指导乙肝病毒外壳蛋

白的合成。（3）获取大量目的基因通常采用PCR技术扩增，即多聚酶链式反应。将目的基

因导入大肠杆菌细胞的方法通常是用Ca2+处理细胞，使其变成易于接受外源DNA的感受

态细胞。（4）筛选含重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和

X-gal,青霉素可以筛选出转入了含目的基因的重组质粒和正常质粒的大肠杆菌，由于重

组质粒中/acZ基因被破坏，而后叱基因可使细菌利用培养基中的物质X-gal,使菌落呈

蓝色，若无该基因，菌落呈白色，故挑选出白色菌落即可。（5）研制血源性疫苗需灭活破坏

乙肝病毒的核酸结构，有可能由于意外因素导致其没有被灭活，导致乙肝病毒在宿主细胞

内大量增殖，从而使接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不

会引发病毒增殖和感染。

答案Q)B(2)指导合成乙肝病毒外壳蛋白(3)多聚酶链式反应Ca2+(4)青霉素

和X-gal白色(5)研制血源性疫苗需灭活破坏乙肝病毒的核酸结构，灭活不成功则会导

致接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不会引发病毒增殖和

感染

3.(2018•河南名校一联)胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。现利用基因工不毁术让大肠

杆菌生产人胰岛素，下图为大肠杆菌质粒，请据图作答：

补充说明：〃/力加、8amHI、&oRI是限制酶切位点和广、az*是抗生素抗性

基因

Q)获取目的基因时，应从人的