华贵栉孔扇贝“南澳金贝”种质标准

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB51FORMTEXT备案号：DB4405006502-2017DB44DB440500/T272—2017FORMTEXT华贵栉孔扇贝“南澳金贝”种质标准FORMTEXTNobleScallop“NanaoGoldenScallop”Germplasm修订（送审稿）2017-02-20发布2017-02-01实施汕头市质量技术监督局发布DB440500/T272—2017前  言本标准按GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定进行编写。本标准与DB440500/T272—2017相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：——修改了规范性引用文件；——修改了“扫描仪”内容；本标准的制定由汕头大学提出。本标准由广东省农业农村厅归口。本标准制定单位：汕头大学。本标准主要制定人：郑怀平、刘合露、张洪宽、周文川、张博、张倩、王亚骏、郭治诚本标准2017年发布，本次为第一次修订。华贵栉孔扇贝“南澳金贝”种质标准范围本标准规定了华贵栉孔扇贝[Chlamysnobilis]“南澳金贝”的主要生物学性状、生长与繁殖、遗传学特性、及检测方法。本标准适用于华贵栉孔扇贝“南澳金贝”的种质检测与鉴定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.1-2008养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则 GB/T18654.2-2008养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法 GB/T18654.12-2008养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析GB/T18654.13-2008养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析GB/T21442-2008栉孔扇贝种质标准术语与定义下列术语和定义适用于本文件。华贵栉孔扇贝“南澳金贝”“GoldenScallop”Chlamysnobilis外观色泽金黄，肌肉组织也呈金黄色的华贵栉孔扇贝。分类位置软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalvia），翼形亚纲（Pterimorphia），珍珠贝目(Pterioidae)，扇贝科(Pectinidae)，栉孔扇贝属（Chlamys）。文件的类别按照标准化对象将本标准划分为：过程标准。主要形态结构特征外部形态特征外形华贵栉孔扇贝“南澳金贝”两枚贝壳外表均为金黄色（图1），贝壳大，近圆形，壳长略小于壳高。左壳较凸，右壳较平。两耳不相等，前耳大，后耳小。壳表具大而等粗的放射肋23条左右，肋上具有翘起的小鳞片。足丝孔具细齿。铰合线直。图1华贵栉孔扇贝“南澳金贝”外形可数性状栉孔齿数目：6～10左壳的放射肋数目：23右壳的放射肋数目：23可量性状壳长5.94～7.78cm的华贵栉孔扇贝可量性状及比值见表1。华贵栉孔扇贝可量性状及比值性状（比值）壳长(cm)壳高(cm)壳宽(cm)体重(g)壳长/壳宽壳长/壳高壳宽/壳高平均值7.117.612.3242.863.070.9340.305标准差±0.405±0.389±0.122±5.58±0.173±0.041±0.019内部特征雌雄异体，成熟个体的雄性生殖腺为乳白色、雌性生殖腺为金黄色（图2）；外套膜为金黄色、紧贴壳缘，外套眼明显；鳃为新月形，左右各一瓣，位于外套膜的内侧。贝壳内面有与壳面相对应的肋与沟；无前闭壳肌、仅有后闭壳肌，闭壳肌粗大可分为明显的横纹肌（金黄色）和平滑肌（白色）两部分。图2华贵栉孔扇贝“南澳金贝”内部形态生态特征食性以虑食浮游植物和有机碎屑为主的杂食性。适宜水温适应生长温度12℃～32℃，最适水温20℃～25℃。生长与繁殖生长华贵栉孔扇贝“南澳金贝”3、4月培育的春季苗种，次年3、4月即可达到商品规格，可以留做亲贝；10、11月培育的秋季苗种，次年10、11月也可达到商品规格，可以留做亲贝。华贵栉孔扇贝在自然条件下壳长（L）与体重（W）关系式见式⑴： (SEQ标准自动公式\*ARABIC1)式中：W——华贵栉孔扇贝壳长L时的体重，单位为克（g）；L——华贵栉孔扇贝体重W时的壳长，单位为厘米（cm）。繁殖性成熟年龄性成熟年龄为1龄。性别一般为雌雄异体。繁殖期每年5月～6月及9月～10月为繁殖盛期。怀卵量平均怀卵量为300万粒/只～1500万粒/只。生殖方式卵生型，分批产卵，体外受精。遗传学特性细胞遗传学特性染色体数体细胞染色体数：2n＝32。核型核型公式：6m+26t，染色体臂数(NF)=38，染色体组型图见图3。图3华贵栉孔扇贝“南澳金贝”染色体组型图生化遗传学特征华贵栉孔扇贝闭壳肌肉乳酸脱氢酶（LDH）同工酶电泳图谱见图4。图4华贵栉孔扇贝闭壳肌肉乳酸脱氢酶（LDH）同工酶电泳图谱检测方法抽样方法按照GB/T18654.2执行。生物学测定用游标卡尺测量壳长、壳高、壳宽等数值（具体测量方法如图4），精确到0.1mm。电子天平称量总重、软体部重（滤纸尽量吸去水）和壳重，精确到0.1g壳长（Shelllength,SL）:前后缘鳞片基部与绞合线平行的最大距离；壳高（Shellheight,SH）:从壳顶至腹缘鳞片基部与绞合线垂直的最大距离；壳宽（Shellwidth,SW）:捏紧两边贝壳使壳宽不再变小时测量其两壳最大距离。染色体标本的制备剪取小块鳃组织，用海水洗净，放入0.4g/L秋水仙素30min；用体积分数为20%的人工海水低渗处理50min（或者用0.075mol/LKCl低渗处理30min）；卡诺氏液（V甲醇：V冰醋酸=3:1）固定约60min，中间换液4次；用体积分数为50%的冰醋酸解离制成细胞悬液；50℃热滴片；空气干燥后用10%Giemsa染液（pH值6.8）染色20min（Giemsa染液配制见附录A）；自来水冲洗，自然干燥后镜检。核型分析观察100个左右的分裂相，选择染色体分散良好的中期分裂相进行染色体计数，统计得出二倍体染色体条数。从中挑选10个分散良好、形态清晰的中期分裂相进行显微摄影、放大、测量，按Levan等确定的分类标准对染色体分类，统计处理测量数据，分析其特征。同工酶电泳分析样品制备随机取活样20尾以上，取闭壳肌，放入离心管，加入0.1mol/L，磷酸缓冲液（见A.1）1000μL，冰浴条件下研磨，全部研磨后倒入离心管，12000r/min4℃离心20min，取上清液置于—20℃冰箱保存备用。凝胶制备由7.5%分离胶和2.5%浓缩胶制成聚丙烯酰胺垂直板凝胶，各种凝胶制备溶液配方见表A.1，凝胶制备配方见表A.2。点样与电泳在电泳槽中分别加入上、下槽电极缓冲液（见表A.3），取样品上清液100μl，加50%甘油50μl和0.05%溴酚蓝10μl，混合均匀后用微量注射器吸取8μl，注入点样孔，置于4℃，220V条件下电泳，至溴酚蓝指示剂到下槽玻璃下缘为止。染色、固定、扫描染色：将电泳胶放入预先准备好的同工酶染色液（见表A.4）中，30℃恒温条件下染色，30～45min直至得到清晰的酶带止。固定：在2.5%的冰醋酸中褪色至底板清晰、透明。扫描：透明后即刻用凝胶成像扫描仪对固定的凝胶进行扫描、保存。结果分析按GB/T18654.13的规定执行。

（规范性附录）

同工酶各种试剂的配制磷酸缓冲液（0.1mol/LpH7.2）的配制A液（0.1mol/L，Na2HPO4）配制：取17.80gNa2HPO4·2H2O或35.82gNa2HPO4·12H2O定容于1000mL纯水中。B液（0.1mol/L，NaH2PO4）配制：取13.80gNaH2PO4·H2O或15.60gNaH2PO4·2H2O定容于1000mL蒸馏水中。磷酸缓冲液：由A液和B液按72:28的比例混合而成，现配现用。凝胶制备凝胶制备溶液配制各种凝胶制备溶液配方见表A.1。各种凝胶制备溶液配方溶液配制方法分离胶缓冲液取Tris56.75g加200mL纯水，用浓盐酸调pH至8.9加纯水到250mL。凝胶储液取丙烯酰胺93.75g，N，N，-亚甲基双丙烯酰胺2.50g溶于纯水中定容到250mL。AP取过硫酸铵17.5mg溶解到10mL纯水中。TEMED（N，N，N，，N，-四甲基乙二胺）分装。浓缩胶缓冲液取Tris5.98g加80mL纯水，浓盐酸调pH至6.7加纯水到100mL。分离胶和浓缩胶的制备用7.5%分离胶和2.5%浓缩胶制成聚丙烯酰胺垂直板凝胶。凝胶制备配方见表A.2。凝胶制备配方7.5%分离胶2.5%浓缩胶分离胶缓冲液，mL0.600.63凝胶储液，mL3.000.34AP，mL1.500.70TEMED，μl2420加纯水至总体积，mL15.005.00电极缓冲液电极缓冲液制备溶液配制方法上槽电极缓冲液母液pH8.3（电泳时稀释10倍）取Tris6.00g，甘氨酸28.80g，加纯水定容到1000mL。下槽电极缓冲液母液（电泳时稀释5倍）取Tris56.75g加200mL纯水，用浓盐酸调pH至8.9，加纯水至250mL。同工酶染色液的配制先配制染色用各溶液见表A.4，再配制染色液见表A.5。染色用溶液配方溶液配制方法1.5mol/LTris-HCL染色缓冲液（pH9.5）取Tris181.75g溶于900mL纯水中，用盐酸调节pH至9.5，再用纯水稀释到1000mL。氯化硝基四氮唑蓝（NBT）取250mgNBT溶于2