DB12T 647-2016 大白菜品种纯度SSR分子标记检测方法

67.050B

31

DB12天津 市 地 方 标 准DB12/T

647—2016大白菜品种纯度

分子标记检测方法Methods

of

identifying

purity

of

Chinese

by

using

2016-09-27

发布 2016-11-01

实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T

647—2016 本标准按照

GB/T

—

给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心。本标准主要起草人：赵新、王超楠、兰青阔、王成、刘莉莉、朱珠、李梅、陈锐、徐石勇。本标准

年

9

月首次发布。DB12/T

647—2016

SSR

1 范围本标准规定了大白菜品种纯度分子标记检测方法的术语和定义、检测方法、纯度计算方法。本标准适用于大白菜单交种的纯度检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

3543.2 农作物种子检验规程

扦样GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1品种纯度

purity品种纯度指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。3.2聚合酶链式反应

chain

reaction（PCR）一种在体外通过酶促反应扩增特异片段的技术。3.3简单重复序列

sequence

repeat（SSR）由几个核苷酸（个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个（一般为）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.4分子标记

以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。4原理SSRPCR技术将多态的扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行大白菜品种纯度检测。DB12/T

647—20165仪器设备及试剂5.1 仪器设备PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000

V，400

，400

W）；万分之一电子天-锅；计等。5.2 试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青TEMED过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；

DNA聚合酶（含Mg的10×PCR缓冲液）；四SSRGold

ViewGB/T6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.3 溶液配制相关溶液配制方法见附录A。6 方法步骤6.1 取样按照GB/T

3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取10

g种子，分别随机取其亲本种子106.2 单粒种子的

DNA

提取6.2.1 样品预处理在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花，用自来水浸湿后均匀地撒上种子，再于表面覆盖一1635℃光照培养，8小时备用。也可采用经验证的、等效的培养条件。6.2.2 DNA

取单株幼苗子叶，放入

mL离心管中，在液氮中研碎，放入

离心管中。将DNA提取液预热到65

65

30

离心管中加入

µL

24:1氯仿-10

g离心

µL转入另一支1.5

mL离心管，加入400

µL

℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10

g离心1

，弃上清液，加入500

µL乙醇—乙酸铵溶液，6000

g5

收集沉淀。加入

µL

TE（pH8.0DNA0.8

%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。使用紫外-可见成像系统观察DNA电泳条带的完整性。6.3分子标记筛选用30对核心引物进行PCR10份DNA互补性好的引物作为纯度检测的SSR分子标记。6.4 PCR

DB12/T

647—20166.4.1 反应体系总体积20

μL，包括

μL超纯水、2

μL含Mg的10×PCR缓冲液、

μL

dNTPs（2.5

）、3.2

μL

SSR

2

μL

Taq

DNA2.5

U/μL2

μL

DNA（30~50

ng/μL6.4.2 反应程序94

℃预变性5

；94

℃变性1

，58

℃退火45

s，72

℃延伸45

s3572

℃延伸7

；

℃保存备用。6.5 变性聚丙烯酰氨凝胶电泳按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。7 纯度计算以筛选出来的分子标记为引物扩增送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下： 纯度%

100%检测样品种子粒数DB12/T

647—2016附录A（规范性附录）溶液配制A.1 DNA提取液含有

Tris-HCl（pH

8.0250

NaCl，25

EDTA，0.5%SDS汽灭菌后使用。A.2引物稀释按照引物合成单的说明先配制100

的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为mmol/L的使用液。A.3 6×变性上样缓冲液去离子甲酰胺49

mL，0.5

的EDTA溶液（

）1mL，溴酚蓝0.125

g，二甲苯青0.125

g。A.4 10×电泳缓冲液Tris

108g，硼酸55

g，

EDTA（pH

8.0）溶液37

，定容至1000

mL。A.540%丙烯胺胶丙烯酰胺

g，甲叉双丙烯酰胺10

g，定容至500

。A.64.5%丙烯胺胶尿素

g，10×电泳缓冲液100

，40%丙烯酰胺胶112.5

mL，定容至1000

mL。A.7 1%亲和硅烷20

μL亲和硅烷，20

μL冰醋酸，加无水乙醇至2

mL。现用现配。A.8 2%剥离硅烷1

mL剥离硅烷，49

mL三氯甲烷。A.9 10%过硫酸铵0.1

g过硫酸铵溶于1

超纯水中。现用现配。A.10 固定液DB12/T

647—2016200

mL冰醋酸，定容至

mL。A.11 染色液4

g硝酸银，定容至2000

。A.12 显影液2000

蒸馏水中加入40

g氢氧化钠和10

甲醛。3’）01BC-1F:

R:

02BC-2F:

R:

03BC-3F:

CTTCCACAGGAGGAGACTGCR:

04BC-4F:

R:

05BC-5F:

R:

06BC-6F:

R:

07BC-7F:

R:

TGCGGTTTGAGCAGTAGTTG08BC-8F:

R:

09BC-9F:

R:

10BC-10F:

R:

11BC-11F:

R:

12BC-12F:

TCCCTCGTGACAAATCTCAAR:

13BC-13F:

R:

14BC-14F:

R:

15BC-15F:

R:

16BC-16F:

R:

17BC-17F:

R:

DB12/T

647—2016附

录 B（规范性附录）30

对核心引物3’）18BC-18F:

R:

19BC-19F:

R:

20BC-20F:

R:

21BC-21F:

R:

22BC-22F:

R:

23BC-23F:

R:

24BC-24F:

R:

25BC-25F:

AACGGATCTGACTTGGCATCR:

26BC-26F:

R:

27BC-27F:

R:

28BC-28F:

R:

29BC-29F:

R:

ACCCACATAGCATGAGAGCC30BC-30F:

R:

DB12/T

DB12/T

647—2016DB12/T

647—2016（规范性附录）制胶过程C.1 凝胶制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦两遍，晾干。在长板上涂1%亲和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。4.5%丙烯酰胺胶80

mL

80

μL和10%过硫酸铵

μL生。灌胶结束后，将梳子齿向外，轻轻的插入胶中，使其聚合1

h以上。C.2 预电泳待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，80

W恒功率下预电泳15

。C.3 变性在20

μL

PCR产物中加入4

μL

6×变性上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95

℃变性5

，4

℃冷却

。C.4 电泳用洗耳球吹洗加样槽