ＤＮＡ粗提取和鉴定实验设计与改进高二下学期生物人教版选择性必修3

ＤＮＡ粗提取和鉴定实验设计与改进本实验为高中生物学选择性必修３《生物技术与工程》中基因工程的实验内容。该实验可以让学生更加直观地通过观察掌握ＤＮＡ的理化性质，也是基因工程中获取目的基因必不可少的实验步骤。然而，该实验本身属于粗提取，最终得到的ＤＮＡ杂质含量较多，会影响ＤＮＡ沉淀的溶解和后续的二苯胺显色反应，也无法继续用做基因工程的实验材料。对ＤＮＡ粗提物进行纯化，并利用超微量紫外可见分光光度计进行ＤＮＡ纯度的检测，获得了较纯的基因组ＤＮＡ，进一步提升了该实验的教学价值，有利于学生通过实验充分掌握ＤＮＡ的性质及其提取的原理，得到的基因组ＤＮＡ也可以用于基因工程的其他实验，如作为ＰＣＲ的模板进行扩增，使得不同实验之间具有连续性，也让学生更深入地理解基因工程的实验设计及原理。实验原理基因组ＤＮＡ位于细胞核内，获取基因组ＤＮＡ首先要将细胞破碎从而释放基因组ＤＮＡ。破碎细胞常用的方法是通过加入含有ＳＤＳ或ＣＴＡＢ等化学试剂的研磨液进行研磨或匀浆。另外，液氮冷冻研磨或蛋白酶处理与加入化学试剂研磨液的联合使用更有利于细胞破碎基因组ＤＮＡ易溶于２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，不溶于酒精。因此可以利用酒精将ＤＮＡ以沉淀的方式析出再用２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀从而获得基因组ＤＮＡ溶液。ＤＮＡ在加热条件下与二苯胺试剂反应可生成蓝色物质，可以通过颜色反应来确认是否成功提取出基因组ＤＮＡ。氯仿／异戊醇可以使蛋白质变性，有助于去除蛋白质，从而纯化ＤＮＡ粗提液。ＤＮＡ在波长为２６０ｎｍ处有最大吸收值，蛋白质在２８０ｎｍ处有最大吸收峰，盐和有机小分子在２３０ｎｍ处有最大吸收峰。纯的ＤＮＡ其１．７＜ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．９，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＞２．０。若ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．７表示存在蛋白质污染，＞１．９则表示存在ＲＮＡ污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＜２．０说明存在盐等小分子污染。实验试剂与方法实验试剂：研磨液，９５％乙醇，氯仿∶异戊醇（２４∶１），３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，１．５％二苯胺试剂。实验方法：以新鲜菜花作为实验材料。１．ＤＮＡ粗提取：称取４ｇ菜花组织置于研钵中，加入７ｍＬ研磨液进行匀浆，匀浆至没有大的组织块，缓慢地将匀浆液转移到１０ｍＬ离心管中，于１２０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ。转移上述上清液至新的离心管中，加入２倍体积９５％乙醇，上下颠倒数次，可见白色ＤＮＡ絮状沉淀。用玻璃棒同方向搅拌将ＤＮＡ絮状物挑出，置于滤纸上吸干多余液体，再转移至新的离心管中，加入２ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，上下颠倒或缓慢吸打，直至ＤＮＡ絮状物完全溶解，得到ＤＮＡ粗提液。２．ＤＮＡ的鉴定：吸取１．５ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液作为实验对照，吸取１．５ｍＬ上述ＤＮＡ粗提液作为实验组。分别在对照组和实验组中加入３ｍＬ二苯胺试剂，混合均匀后，于沸水浴加热５ｍｉｎ，观察并比较两者颜色的变化。３．ＤＮＡ的纯化：从剩余的ＤＮＡ粗提液中吸出２０μＬ备用，作为未纯化的基因组ＤＮＡ对照。向剩余的ＤＮＡ粗提液中加入５００μＬ氯仿∶异戊醇（２４∶１），上下颠倒混匀２ｍｉｎ，１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ。将上清液转移至新的离心管中，加入１／１０体积的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，轻柔颠倒混匀，再加入２倍体积的９５％乙醇，轻柔颠倒混匀后，１２０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，管底的沉淀即基因组ＤＮＡ。缓缓倒掉上清液，室温待沉淀晾干后，加入１００μＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀，最终获得纯化的基因组ＤＮＡ。分别取２μＬ未纯化和纯化后的基因组ＤＮＡ溶液，利用超微量紫外可见分光光度计测定ＤＮＡ的纯度。结果与分析１．ＤＮＡ粗提液的二苯胺鉴定：在获得的１．５ｍＬ菜花组织ＤＮＡ粗提液中加入３ｍＬ１．５％的二苯胺试剂，沸水浴加热５ｍｉｎ。结果显示，与对照组（ＮａＣｌ溶液＋二苯胺试剂）相比，ＤＮＡ粗提液呈现明显的蓝色（图１），说明本次实验成功将基因组ＤＮＡ提取出来，且ＤＮＡ量较多，足以进行二苯胺颜色反应，可以肉眼观察到明显的颜色差异。２．不同破碎方法对ＤＮＡ粗提取的影响：为了获得尽量多的组织研磨液，结合目前组织研磨常用的方法，分别采用破壁机电动匀浆、采用玻璃匀浆器和研钵手动匀浆。其中研钵研磨分为添加液氮研磨和不添加液氮研磨两种方式，比较以上４种研磨方法对ＤＮＡ粗提取效果的影响。结果显示，利用破壁机电动匀浆进行组织破碎，在破碎过程中会产生大量泡沫影响破碎过程，且破碎过程中会产生热量，导致ＤＮＡ断裂，呈现均匀的短片段，无法通过玻璃棒搅拌将ＤＮＡ絮状物取出。这种现象同样也出现在使用研钵研磨并且添加液氮的方法中。液氮研磨可以通过制造低温保证ＤＮＡ不被胞内核酸酶降解，但是当加入液氮进行研磨后，在上清液中加入２倍体积的乙醇后ＤＮＡ不能形成絮状物，而是呈现均匀分布的小片段，不利于后续用玻璃棒搅拌获取ＤＮＡ的操作。与上述两种方法相比较，使用玻璃匀浆器和研钵研磨得到的组织破碎液，加入乙醇后能够肉眼看到大量白色ＤＮＡ絮状物，可以用玻璃棒通过搅拌的方式将ＤＮＡ絮状物取出。由于ＤＮＡ的二苯胺颜色反应中，需要有足够多的ＤＮＡ，因此需要较多的植物组织。利用玻璃匀浆器研磨，因其空间较小，且玻璃易碎，研磨量大的组织费时费力，所以利用研钵更有利于大量植物组织的研磨。３．ＤＮＡ粗提液经纯化后的纯度变化：由于ＤＮＡ粗提液中仍然含有大量的杂质，如蛋白质等，纯度太低，导致ＤＮＡ粗提取过程中出现ＤＮＡ沉淀不易溶解的问题，且纯度低的基因组ＤＮＡ无法用于基因工程中的相关酶促反应，如ＰＣＲ等。利用氯仿／异戊醇将获得的ＤＮＡ粗提液进行纯化，利用超微量紫外可见分光光度计对未纯化和纯化的基因组ＤＮＡ进行纯度检测。结果发现，未纯化的基因组ＤＮＡ其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．２３，比值远小于１．８，说明该ＤＮＡ粗提液中含有蛋白质污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝１．１９，比值远小于２．０，说明该ＤＮＡ粗提液中可能含有小分子有机物的污染（表１）。而纯化后的基因组ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８７，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝２．０６，说明ＤＮＡ纯度较高，基本不含蛋白质和小分子的污染（表１）。在ＤＮＡ粗提取实验中，最关键的一步就是破碎细胞使得基因组ＤＮＡ得到释放。另外，本实验采用二苯胺试剂进行ＤＮＡ的鉴定，ＤＮＡ在４０—４００μｇ范围内，与二苯胺试剂反应生成的蓝色物质吸光度与ＤＮＡ浓度呈线性关系。如果ＤＮＡ含量太低则二苯胺显色反应无法得到预期的结果。想要达到肉眼明显可见的蓝色，提取的ＤＮＡ含量需达到每毫升百微克，这就在破碎细胞提取ＤＮＡ时需要较多的植物组织。这样就带来一定的问题：①研磨费时费力，