DB12∕T 1006-2020 茄子黄萎病菌土壤带菌 PCR 检测技术规程

DB12TechnicalregulationofPCRdetectionforverticilliumdahliaeinsoil天津市市场监督管理委员会发布I本标准按照GB/T1.1-2009给本标准主要起草人：高苇、王勇、杨利娟、贲海燕、张春祥、刘晓琳、姚玉荣、王万1茄子黄萎病菌土壤带菌PCR检测技术规程GB/T6682分析实验室用水规格和GB/T36197-2018土壤质量土壤采样GB/T36199-2018土壤质量土壤采样程序茄子黄萎病菌verticilliumwiltofeg茄子黄萎病菌大丽轮枝菌（VerticilliumdahliaKleb.）可以侵染多种植物引起一种土传的维管微菌核verticilliumwiltofe4.1主要仪器量0.1g和0.1mg）、电泳仪、4.2主要试剂2水饱和酚、三氯甲烷、液氮、异丙醇、无水乙醇、DNA荧光染料（GelRed）、Tris-HCl等。DNA分子量标准（DNAMarker，能够区分1），PCR反应混合物：2×MasterMix:TaqDNA聚合酶，2×PCR反应缓冲液，dNTP混合每个样品设置3个重复3个平行，每个重复称取1g土样，取上清液，加入等体积水饱和酚，充分混匀后，4℃14000g取上清液，加入等体积的三氯甲烷:异戊醇（24:1），4℃14000g离心10min。继续三氯甲烷:弃去上清液，70％冷乙醇，漂洗DNA沉淀2萎病菌1g土壤提取的DNA，阳性对照为含茄子黄萎病菌1g土壤提取的DNA空白对照为未加入DNA模3检测判定完成后，土壤样品保存方法按照GB/T36197-2018有关要求执行。检测判定过程及有关数4A.1病原及其分类地位从梗菌科（Moniliaceae），轮枝菌属（Verticillium）。已报道的茄子黄萎病的病A.2病原特征辣椒等多200多种农作物，其形成的微菌核在无寄主的土壤中可存活10年以上，是主要的初侵A.3症状及危害5Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’引物序列：Vd-ITS1-45-F：5’-CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’Vd-ITS2-379-R：5’-ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3’ 1ccggtccatcagtctctctgtttataccaacgatacttctgagtgttcttagcgaactat61taaaacttttaacaacggatctcttggctctagcatcgatgaagaacgcagcg121atatgtagtgtgaattgcagaattcaggaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgcct181tccagtatcctgggaggcatgcctgtccgagcgtcgttt241ccggtgttggggatctacgtctgtaggcccttaaaagcagtggcggacccgcgtggccct301301tcctatgcgtagtagttacagctcgcatcggagt56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10体积(μL）EeraldAmpMaxPCRMasterMix（2×MasterMixCodeRR320）111PCR扩增产物电泳后，在凝胶成像系统中检测。观察电泳结果（如