TCVMA 163-2024 动物分枝杆菌多重荧光熔解曲线检测方法

T/CVMA163—2024动物分枝杆菌多重荧光熔解曲线检测方法Mutiplexfluresencemeltingcurveanalysisfordetectionofmycobactrium2024-5-23发布2024-5-23实施中国兽医协会发布I12规范性引用文件GB/T6682分析实验室用水NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4符号和缩略语DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraITS：内转录间隔区（InternalPBS：磷酸盐缓冲液（PhosphatebuffersaPCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactioTm值：在热变性过程中，随着温度的逐渐升高，探针逐渐从靶序列上脱落，其双链解链到一半时所对应的温度称为他们的熔解温度（MeltingTemperUNG：尿嘧啶DNA糖基化酶（UracilN-Glycosylase）5试剂和耗材5.1试剂25.1.10TritonX-100：商品化试剂。5.1.12多重实时荧光PCR检测（熔解曲线5.2.1无菌注射器。5.2.2真空采血管。5.2.3无菌离心管。5.2.5微量移液器吸头（与微量移液器相应规格适配）。5.4阳性靶标序列及质粒6仪器与设备3灭菌并烘干，或160℃干烤1h灭菌；或使用一次性无菌用等效工具。分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。采集混有黏液、血液、黏膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深4取1mL～2mL全血样品，15000g离心10min，弃上清液；加等量体积灭菌双蒸水充分振荡，15000g离心10min；弃上清液，若红细胞裂解不完全，应采用无菌双蒸水重复洗涤；收0.01mol/LpH7.6PBS重悬沉淀，充分振荡混匀；将沉淀悬浮液移入微量离心管，15000g离心10min；在痰液样品加入2倍～4倍体积4%氢氧化钠消化液，振荡混匀，室温离心10min，弃上清液，重复本步骤一次；收集沉淀分别从三个不同的位置取适量的组织样品，剪碎，按1:5的比例加入柠檬酸钠磷酸缓冲液，充分研荡，75℃温浴0.5h～1h；取上清液，15000g离心10min；弃上清液，加等量0.01mol/LpH7荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤1次），室温静置0.5h～1h；取上层约3mL液体（避免吸取粗渣），5000g离心1min，取上清液，15000g离心10min；弃上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，充分振荡混匀，15000g离心10在处理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴30min，98℃~上清液，直接用于PCR或贮存于-80℃备在处理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴30min，9858.2.3PCR反应液配液标准为：分别取（n注：n=实际检测样品所需测试数+阳性对照测试数+阴性对照测试8.2.5将配制好的PCR反应管装入自封袋转移至至样品制备区。贮存在2℃~8℃之间直至样品提取8.3.2用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应9结果判定9.1结果分析条件设定9.2试验成立的条件——ROX通道只出现74.9℃~82.9℃（内控熔点）的熔解峰；6——FAM通道只出现56.5℃~63℃（结核分枝杆菌复合群特异熔点）的熔解峰；——ROX通道出现67.9℃~74.5℃（分枝杆菌属特异熔点——ROX通道出现74.9℃~82.9℃（内控熔点9.2.39.2.1和9.2.2要求须在同一次试验中同时满足，否则，本次试验9.3结果判定样品在ROX通道只出现74.9℃~82.9℃（内控熔点）的熔解峰，其他通道均无熔解峰，则表示阳性样品判读依据对于每一份样品，其在ROX通道74.9℃~82.9℃处应有熔解峰（内控否则该样品检测无效；根据样品在ROX通道67.9℃~74.5℃处是否有熔解峰进行判读，若无熔解峰，则样品不含分枝杆菌，单一感染阳性判定样品在ROX通道出现67.9℃~74.5℃（分枝杆菌属特异熔点）和74.9℃~82.9℃（内控熔点）耻垢分枝杆菌：FAM通道76.0℃~83.0℃;瘰疬分枝杆菌：FAM通道63.5℃~72.0℃;结核分枝杆菌复合群：FAM通道56.5℃~63.0℃;龟分枝杆菌：FAM通道49.0℃~56.0℃;副结核分枝杆菌：HEX通道66.5℃~75.1℃,Cy5通道61.9℃~69.9℃;堪萨斯分枝杆菌：HEX通道60.5℃~66℃;偶然分枝杆菌：ROX通道61.8℃~67℃;溃疡分枝杆菌或海分枝杆菌：ROX通道52.7℃~60.7℃;胞内分枝杆菌：Cy5通道61.9℃~69.9℃;鸟分枝杆菌：Cy5通道54.9℃~61.5℃。混合感染阳性判定9.3.3样品无效出现这种情况的原因可能是样品经提取后核酸中含有抑制PCR反应的杂质或者实验人员操作出现错79.3.4可能影响检测结果的因素准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测10.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行,不同区域配备独立的加样工具和用具。该区域可以是器应能耐受煮沸、10%次氯酸钠溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及10.5PCR反应液等试剂应按检测需求分10.7上机运行前，应检查盖紧各PCR管，8DNA提取试剂的配制A.1柠檬酸钠磷酸缓冲液A.20.5mol/LEDTA（pH8.0）称取186.1gEDTA，加入到800mL蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调pH值至8.0定容至1L，分装后121℃±2℃高压灭菌15min，室温贮存。A液（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：称取一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）27.6g，或二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）31.2g，溶于蒸馏水中，定容B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液称取十二水磷酸氢二钠磷酸氢二钠（Na2HPO4•2H2O）35.6g，溶于蒸馏水中，称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液加87mLB液，用蒸馏水定容A.4氢氧化钠消化液取35g～40gNaOH，2g钾明矾，20m按比例加入），加入1L蒸馏水混匀，即为氢氧化钠消化液。A.5DNA提取液A.64%硫酸浓度取98%的浓硫酸10毫升（含硫酸10*98%*1.9序列信息(5′→3′)通用引物-R1GCGTTTTCGGCGGTTTGTCAAACTTTTTTGACTGCCAGACA海/溃疡探针-P6>CP072765.1:1473145-1473795MycobacteriumtuberculosisstraH37Rv_CGchromosome,compleTGCATGACAACAAAGTTGGCCACAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTT>LN831039.1:3901029to3901329MycobacteriumsmegmatisgenACGAGAGACACTCTCCGTTGGGGAGGGTGTGAGCCGTGAGGAGGAGCGCTGTAGTGGCGCCGGCTTGGGCCCTGAGACAACAGGCCCGTTGTTCCCTGGCCACTGTGTGGGGAGGCGTGTTGTTGCCCTGCTTTGGTGGTGGGGTGTGchelonaestrainDSM43chromosome,completeGGCACACTGTTGGGTCCTG>LR031415.1:28to309MycolicibacteriumfortuitumDNAspacerregion,strainKACGAAAAGGGTTGAGACACTGGGTCTTACCCGAGCCGTGAGGAACCGGTTGCCTGTAGTGGGCACGGTTTGGTGCACAACAAACTTTTTTGTTTTGGGGGGTGGCATCCGGTT>LR135168.1:4406391to4406635MycobacteriumulceransstrGTCTGTAGTGGACGGAAGCCGGGTGCA>LR031430.1:28to271MycobacteriumintracellulareATCCintergenicspacerregion,KM06-472ACGAAAAGCACTCCAATTGGTGGG>CP046507.1:3010473to3010741MycobacteriumaviumsubsstrainDSM44156chACGAAAAGCACCCCAACTGGTGGGGTGCGAGCCGTGAGGGGTTCC>AB026702.1:101to345MycobacteriumscrofulaceumDNAACGAAAAGCACCCCAACTGGTGGGGTGCGAGCCGTGAGGGGTTCT菌>LR031424.1:28to272MycobacteriumkansasiiDNAcontaining16S-23Sintergenicspacerregion,strainKM0ACGAAAAGCATCCCAACAAGTGGGGTGCGTCTGTAGTGGACGAAAGCCG菌>CP053068.1:4756908to4757254MycobacteriumaviumsubparatuberculosisstrainDSM44135chromosome,complete>LR782542.1:8037817to8037Arabidopsisthaliana