《子宫颈癌PD-L1免疫组织化学检测规范》（征求意见稿）

T/CRHAXXX-202X子宫颈癌PD-L1免疫组织化学检测规范本文件规定了子宫颈癌PD-L1免疫组织化学检测的适用人群、免疫组织化学检测、质控要求、报告模板。本文件适用于各级医疗机构病理医务人员进行子宫颈癌PD-L1免疫组织化学检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T40352人类组织样本采集与处理CNAS-CL02-A007：2018医学实验室质量和能力认可准则在组织病理学检查领域的应用说明3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1子宫颈癌cervicalcancer发生在子宫颈部位的恶性上皮性肿瘤，通常与人乳头瘤病毒（HPV）感染相关。3.2程序性死亡配体-1programmeddeath-Ligand1，PD-L1PD-L1是程序性死亡配体-1，是一种膜表面蛋白，通常在癌细胞和某些免疫细胞上表达。通过与免疫细胞上的PD-1受体结合，PD-L1可以抑制免疫细胞的活性，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击。3.3免疫检查点抑制剂immunecheckpointinhibitors一类靶向免疫检查点的药物，通过解除免疫系统对肿瘤细胞的免疫抑制，从而增强免疫系统对肿瘤细胞的攻击力。PD-1/PD-L1抑制剂就是其中一类免疫检查点抑制剂。3.4免疫组织化学immunohistochemistry，IHC一种检测组织中特定抗原的方法，通过使用抗原特异性的抗体和适当的染色方法，可以在组织切片上定位和可视化特定蛋白质。3.5伴随诊断adiointdiagnostic2T/CRHAXXX-202X利用特定的检测方法，如分子技术、免疫组化染色等检测与特定药物相关联的基因改变及蛋白表达情况，来提供给患者对某种特定治疗方法的反应信息，有助于确定患者是否可以从该药物中获益。3.6伴随诊断试剂adiointdiagnosticreagent药物在临床使用时提示患者使用相应药物安全有效性的体外诊断试剂，医生可根据伴随诊断试剂所给出的结果进行临床治疗方案的调整及预后评价3.7综合阳性评分combinedpositivescore，CPS评估PD-L1表达水平的一种评分方法，结合了PD-L1阳性肿瘤细胞、相关免疫细胞和其他细胞（详见附录）的数量，用于预测患者对PD-1/PD-L1抑制剂治疗的反应。3.8一抗primaryantibody特异性结合到目标抗原的抗体，常用于免疫组织化学、免疫荧光等实验。3.9二抗secondaryantibody结合到一抗的抗体，通常带有荧光或酶标记，用于检测和放大信号，从而实现目标抗原的可视化。3.10克隆号clonenumber用来标示单克隆抗体的抗原表位的,标示筛选这个抗体来源的细胞株。4缩略语下列缩略语适用于本文件。H&E染色法——苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinStaining)ORR——客观缓解率（Objectiveresponserate）MICs——细胞质染色的单核炎症细胞（Cytoplasmicstainingofmononuclearinflammatorycells）NMPA——国家药品监督管理局（NationalMedicalProductsAdministration）FDA——美国食品药品监督管理局（U.S.FoodandDrugAdministration）NCCN——美国国立综合癌症网络（NationalComprehensiveCancerNetwork）FFPE——福尔马林固定的石蜡包埋样本（FormalinFixationandParaffinEmbedding）5子宫颈癌免疫监查点抑制剂的适用人群PD-L1检测的人群以药物获批的适应症目标人群为主。如，帕博利珠单抗pembrolizumab(Keytruda)联合化疗，联合或不联合贝伐单抗，用于治疗持续性、复发性或转移性子宫颈癌；赛帕利单抗适用于接受过一线或以上含铂标准化疗后进展的复发或转移、PD-L1表达阳性（CPS≥1）子宫颈癌。注：虽然临床用药前对PD-L1检测的适用人群有一定规定，但是在病理临床实践中，有时不能判断或不能及时知晓其用药选择，因此，建议在兼顾检测成本、临床送检需求与实际操作的前提下，尽量为所有可能具有免疫治疗机会的子宫颈癌患者提供PD-L1免疫组化检测结果。3T/CRHAXXX-202X6子宫颈癌PD-L1免疫组织化学检测6.1样本类型首选手术切除标本，切除标本不可及的情况下，可选择活检的组织学标本，由于子宫颈癌PD-L1的表达采用CPS评分，免疫细胞的计数相对复杂，不推荐使用细胞包埋蜡块进行检测。6.2样本前处理要求6.2.1样本选择及处理新鲜活检或手术样本组织，样本处理应符合GB/T40352的要求，经10%中性福尔马林固定，参照《临床技术操作规范-病理学分册》取材、固定、脱水、石蜡包埋并制成蜡块。6.2.2组织切片操作方法组织切片厚度建议4μm。将切片黏附在聚赖氨酸载玻片或带正电荷的玻片上，在空气中略干燥后，60°C～65°C烤片2小时，2～8℃或25±2℃存放待用。为了防止抗原降解，准备好的组织切片应尽快使用。如需保存，2～8℃条件下保存的切片，需在16周内完成检测；25±2℃条件下保存的切片，应在4周内完成检测。注：研究显示3个月的样本PD-L1阳性率为31.2%；≥3个月至1年的阳性率为32.8%，1～3年为29.1%3年为13.3%(n=83)，尽量选择3年以内的蜡块进行检测。对于复发和转移的患者，如无法取得近期的组织进行检测，可考虑三年内的样本。6.3免疫组化检测6.4子宫颈癌PD-L1表达的判读标准6.4.1判读要求应由具有资质的病理医生使用光学显微镜对PD-L1染色结果进行评估。在检查用于PD-L1染色的患者标本之前，检查用于评估染色质量的对照非常重要。建议选择3张连续组织切片（H&E、PD-L1染色和空白对照染色）进行PD-L1染色评估。首先对H&E切片进行样本可使用性评估,如通过，则剩余2个连续切片的IHC染色是可接受的。6.4.2样本可用性评估确认至少有100个可计数肿瘤细胞，建议使用H&E染色切片评估标本是否足够可用。应对标本同一石蜡块的连续切片进行PD-L1免疫组化和H&E染色。PD-L1染色切片中必须存在至少100个可计数肿瘤细胞，以确保标本足够用于PD-L1评估。如可计数肿瘤细胞少于100个的样本，建议选用同一蜡块的深切切片或另一蜡块的组织切片，确保有足够数量的可计数肿瘤细胞用于PD-L1免疫组化染色评估。6.4.3子宫颈癌PD-L1染色强度，阳性和阴性对照组织阳性及阴性对照可采用组织样本或细胞系对照切片。1）使用组织样本评估整体染色强度，如图1所示：4T/CRHAXXX-202X1+/弱阳只在40×物镜下可见清晰细胞膜染色2+/中阳4-5×物镜下可见，10-20×物镜下可见清晰细胞膜染色3+/强阳4-5×物镜下可见清晰细胞膜染色ABACDC图1PD-L1（克隆号：WD160）在子宫颈癌样本中的染色强度评估，其中：A:无肿瘤细胞染色（20X放大）；B：1+肿瘤细胞PD-L1染色（20X放大）；C：2+肿瘤细胞PD-L1染色（20X放大，如箭头所示D：3+肿瘤细胞PD-L1染色（20X放大，如箭头所示）。2）使用细胞系对照切片评估，如图2、图3所示：检查PD-L1IHC22C3pharmDx细胞系对照切片，确定试剂是否正常发挥作用。每个切片含有PD-L1表达呈阳性和阴性的细胞团块切片。评估阳性细胞的百分比和染色强度。如果细胞系对照切片的染色不理想，则患者标本的所有结果均应视为无效。对于PD-L1阳性细胞团块，以下染色可接受（见图2）：①≥70%的细胞呈细胞膜染色；②平均染色强度≥2+；③非特异性染色强度<1+。图2PD-L1（克隆号22C3）阳性对照细胞团块对于PD-L1阴性细胞团块，以下染色可接受（见图3）：①多数细胞应显示无染色。注：细胞膜明显染色的细胞≤10个即视为可接受；②非特异5T/CRHAXXX-202X图3PD-L1（克隆号22C3）阴性对照细胞团块FFPE的扁桃体可作为对照标本。PD-L1染色的扁桃体隐窝上皮细胞膜表现为强染色；生发中心的巨噬细胞表现为中等到弱的膜染色（见图4），血管内皮细胞、纤维细胞和表面鳞状上皮细胞无染色。FFPE的胎盘组织可作为对照样本。PD-L1染色的胎盘组织滋养层细胞膜：细胞膜呈很强的一致性染色；胎盘间质组织和脉管系统没有染色（见图5）。图4PD-L1（克隆号：WD160）染色的扁桃体（20X放大）间质细胞无染间质细胞无染图5PD-L1（克隆号：WD160）染色的胎盘组织（20X放大）4）空白对照抗体试剂6T/CRHAXXX-202X检查空白对照抗体试剂染色的切片，确定可能干扰PD-L1染色判读、使标本无法评估的非特异性背景染色。无染色表明对照合格。检查空白对照抗体试剂染色的患者标本，确定是否存在可能干扰PD-L1染色切片判读的任何非特异性染色。6.4.4子宫颈癌PD-L1判读方法子宫颈癌中PD-L1蛋白的表达水平采用CPS来确定，即PD-L1阳性细胞与可计数肿瘤细胞的比例乘以100，其中纳入评分的PD-L1阳性细1）任何强度下具有完整或部分细胞膜染色的肿瘤，但仅有细胞质染色的肿瘤细胞不纳入评2）任何强度下位于肿瘤巢内或相邻的基质内直接与肿瘤反应相关的细胞膜染色和/或细胞质染色的淋巴细胞和巨噬细胞。其他的CPS评分公式纳入/排除的标准见附录C表1和表2。3）肿瘤异质性样本的判读见附录D。6.4.5子宫颈癌PD-L1检测规范化报告模板子宫颈癌PD-L1检测报告除患者基本信息，还应包括样本类型、试剂克隆号，质控结果、检查测结果等。见附录E7子宫颈癌PD-L1检测的质控要求为保障子宫颈癌PD-L1检测结果的准确性，实验室质量管理应符合CNAS-CL02-A007：2018的要求。7.1室内质控室内质控应满足以下要求：1）确保检验试剂和方法的正确性，采用的试剂符合NMPA及相关法规要求，且在用于临床诊断前，对试剂和检测方法进行充分的验证，保证结果的准确性和可重复性。室内质控应设置阳性和阴性对照。2）可采用已知PD-L1表达结果的样本（最好兼具高表达（CPS≥10）、中表达（CPS1-10）、及低表达CPS＜1）。3）阳性对照样本可以是扁桃体（隐窝上皮细胞膜表现为强染色，生发中心的巨噬细胞表现为中等到弱的胞膜染色，血管内皮细胞、纤维细胞和表面鳞状上皮细胞无染色。）和胎盘组织（滋养层细胞膜很强的一致性染色，胎盘间质组织和血管内皮细胞无染色）。4）应进行PD-L1抗体不同克隆号和染色平台的比对，对不同操作人员进行定期抽检。规范进行实验记录，可溯源，同时对操作和判读人员进行定期培训和考核。7.2室间质评进行子宫颈癌PD-L1检测的实验室每年应至少参加2次室间质评，既可以通过参加国内外权威机构举办的室间质评活动完成，也可以通过与其他获得相应资格认可和使用相同方法学的实验室进行比对完成。7T/CRHAXXX-202X（资料性）免疫组织化学染色操作流程（手工染色）A.1检验所需仪器、设备a)移液器；b)免疫组化油笔；c)电磁炉或高压锅（也可使用自动抗原修复仪）；d)孵箱；f)孵育盒；g)染色架；h)盖玻片；j)洗瓶。A.2溶液配制PBST磷酸盐缓冲液（0.01M，0.05%Tween-20，pH7.4）、免疫组化抗原修复缓冲液以及DAB显色液的配制参见各产品说明书。A.4检测步骤将福尔马林固定石蜡包埋切片于60℃~65℃孵箱中烤片1～2小时，室温保存备用。a)石蜡切片置于新鲜二甲苯中，浸泡10分钟×2次；b)去除多余的液体后，置无水乙醇中，浸泡3分钟，1～2次；c)去除多余的液体后，置95%乙醇中，浸泡3分钟；d)去除多余的液体后，置85%乙醇中，浸泡3分钟；e)去除多余的液体后，置70%乙醇中，浸泡3分钟；——推荐使用pH9.0EDTA热修复法，水浴可设置98。C高温修复20～30分钟；——若使用高压修复法，建议修复2～3分钟（高压阀门顶起时开始计时），完成修复后，让切片自然冷却至室温；——用免疫组化油笔将待测组织圈起来，纯化水冲洗2次，每次3分钟。滴适量（约150µL）内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10分钟后，纯化8T/CRHAXXX-202X加入1～3滴（50-150ul）PD-L1抗体试剂或空白对照抗体试剂完全覆盖组织，室温孵育30分钟后，PBST冲洗3次，每次5分钟。被检切片依照所用染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行孵育，完毕后PBST冲洗3次，每次5分钟，纯化水冲洗2次，每次3分钟。依照所用试剂说明书进行DAB显色液配制，滴适量配制好的DAB显色液完全覆盖组织，依据颜色变化终止染色，纯化水冲洗3次（必要条件下可使用DAB增强液染色）。依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行衬染，PBST或依次浸泡梯度酒精70%，85%，95%，100%（1～2次），每次3分钟；2次二甲苯透明，用中性树胶对切片进行封片。T/CRHAXXX-202X（资料性）CPS评分公式纳入/排除的标准B.1表1CPS评分公式分子纳入/排除标准-与溃疡有关的MICs(包括淋无B.2表2：CPS评分公式分母纳入/排除标准无无T/CRHAXXX-202X（资料性）肿瘤异质性样本的判读肿瘤异质性样本的判读，可按照以下方法进行：1）较低放大倍数下（4倍）：目测将肿瘤区域划分为细胞数量接近的若干部分（见图C.1）图C.1低倍镜下，将肿瘤区域划分为细胞数量接近的几部分2)在更高的放大倍数（20倍）下：观察每个区域和评估存活的肿瘤细胞和PD-L1染色细胞（肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）的总数。计算每个地区的综合阳性分数（见图C.2）图C.2在更高的放大倍数（20倍）下：观察每个区域和评估存活的肿瘤细胞和PD-L1染色细胞（肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）的总数。如图所示四个区域有~80、~30、~50和~100个PD-L1染色细胞（肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）。每个切片有100个肿瘤细胞（包括PD-L1染色细胞）。每个区域的CPS：~CPS80、~CPS30、~CPS50和~CPS100。计算整个肿瘤区域的综合阳性评分（CPS）：（80+30+50+100）/4=~CPS65。T/CRHAXXX-202X（资料性）子宫颈癌PD-L1检测规范化报告模板图子宫颈癌PD-L1检测报告模板T/CRHAXXX-202X参考文献[1]NCCNGuidelinesVersion1.2023CervicalCancer.[2]中华医学会妇科肿瘤学分会．妇科肿瘤免疫检查点抑制剂临床应用指南.协和医学杂志，2021:12(6):854—880.[3]PD-L1IHC22C3pharmDxInterpretationManual–CervicalCancer.FDA-approvedforinvitrodiagnosticuse.[4]FDAapprovespembrolizumabcombinationforthefirst-linetreatmentofcervicalcancer.FDA.UpdatedOctober13,2021.AccessedDecember1,2021.https://bit.ly/3G5r6yd[5]ColomboN,DubotC,LorussoD,etal;KEYNOTE-826Investigators.Pembrolizumabforpersistent,recurrent,ormetastaticcervicalcancer.NEnglJMed.2021;385(20):1856-1867.doi:10.1056/NEJMoa2112435[6]/immuno22hybrid/attendee/confcal/show/session/33(79P-EfficacyandSafetyofZimberelimab(GLS-010)MonotherapyinPatientswithRecurrentorMetastaticCervicalCancer:AMulticenter,Open-Label,