羟丙基壳聚糖制备的研究

PAGE2基金项目：国家自然科学基金（31071538）1作者简介：冯炜玮（1986-），男，陕西咸阳人，硕士研究生，研究方向：药物生物化学。E-Mail:fweiweiking217@126.com。联系电话：158987515343通讯作者：陈志伟（1972-），男，博士，教授,主要研究方向：动物营养学,分析化学。E-Mail:chen@。羟丙基壳聚糖制备的研究冯炜玮1，迟骁玮1，孔维琴2，陈志伟3（1山东理工大学生命科学学院，山东淄博255049；2山东理工大学化学工程学院，山东淄博255049）摘要：本实验以异丙醇为介质，应用碱化交联法制备了水溶性羟丙基壳聚糖，正交设计法优化制备反应条件，茚三酮法测定羟丙基化取代度。结果表明：M壳聚糖：V环氧丙烷：V四甲基氢氧化铵=1：10：0.5、温度60℃、反应时间6h，此条件下所制得羟丙基壳聚糖平均取代度为0.42，具有良好的水溶性。关键词：羟丙基壳聚糖；碱化交联法；制备；取代度ResearchonPreparationofHydroxypropyl-ChitosanFengWei-wei1,ChiXiao-wei2,KongWei-qin2,ChenZhi-wei*(1SchoolofLifeScience,ShandongUniversityofTechnology,ZiBo,255049China;2SchoolofChemicalEngineering,ShandongUniversityofTechnology,ZiBo,255049China)Abstract:Inaddition,Hydroxypropyl-Chitosanwaspreparedbythemethodofalkalizationandcrosslinking,withisopropanolasmedium.Thereactionconditionswereoptimizedbyorthogonaldesign,thedegreeofsubstitutionwasdeterminedbytheninhydrinreaction.Asaresult,thebestreactionconditionswerelikethese:theratioofMass(chitosan):Volume(propyleneoxide):Volume(tetramethylammonium-hydroxide)were1:10:0.5,thereactiontemperaturewas60℃andreactiontimewas6h.Undertheseconditions,thedegreeofsubstitutionofHydroxypropyl-Chitosanwas0.42onaverage,andalsowithabetterwatersolubility.Keywords:Hydroxypropyl-chitosan;alkalizationandcrosslinking;preparation;degreeofsubstitution前言壳聚糖(Chitosan，简称CS)是天然多糖中唯一的碱性多糖，是甲壳素经浓碱处理脱去N-乙酰基的产物，含有游离的一级氨基，即β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，分子量一般在1×105～6×105，CS可通过体内溶菌酶的作用，分解为葡胺糖，被人体吸收。因其来源丰富、无毒，且具有优良的生物相容性和阻止药物扩散及溶出等特性，可很好地用于药物载体[1-2]。但CS水溶性较差，只溶于弱酸，不溶于水和许多有机溶剂，很大程度上限制了它的应用[3]。将CS羟丙基化制备成羟丙基壳聚糖(hydroxypropylchitosan，简称HPCS)，由于在CS分子上引入了羟丙基团，改变了分子的空间结构，削弱了CS分子间和分子内的氢键作用，不仅保留了CS碱性和正电性，同时还提高了水溶性及反应活性，且应用范围更为广泛，已有报道HPCS应用于离子吸附、纺织品除菌以及药物缓释等方面[4-8]。本实验采用碱化交联法制备了水溶性羟丙基壳聚糖，并对比了其制备过程中主要条件的相互关系，为CS水溶性衍生物的进一步制备提供了理论依据。1材料与方法1.1材料与仪器壳聚糖（粘度<100cps，脱乙酰度>90.0%，上海蓝季科技发展有限公司）；环氧丙烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；四甲基氢氧化铵（分析纯，上海科丰化学试剂有限公司）；异丙醇（分析纯）；无水乙醇（分析纯，）；丙二醇（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）；茚三酮（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）；丙酮；NaOH水溶液、盐酸；浓硫酸（分析纯，山东莱阳经济技术开发区精细化工厂）。增力电动搅拌器（江苏金坛双捷实验仪器厂，JJ-1型）；加热磁力搅拌器（江苏金坛晶玻实验仪器厂，78-1型）；真空干燥机（上海一恒科学仪器有限公司，DZF-6020型）；傅立叶变换红外光谱仪（美国Nicolet仪器公司，Nicolet7500型）；电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂，）；比色管（上海申玻仪器公司，25mL型）；紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司，TU-1810型）；分析天平（上海天平仪器厂，FA-1640型）；隔膜真空泵（天津腾达过滤器件厂，GM-0.33型）。1.2方法1.2.1HPCS的制备准确称取2gCS与反应容器中，先后加入适量30%的NaOH溶液和异丙醇，混合均匀，室温匀速搅拌1h，4℃密封冷藏过夜。加入1mL催化剂四甲基氢氧化铵，匀速搅拌环境下缓慢滴加过量环氧丙烷，于60℃搅拌反应6h，反应结束后冷却至室温。用盐酸调节pH到7，沉淀、抽滤，用无水乙醇充分洗涤，60℃真空干燥即得到白色或淡黄色固体粉末HPCS[9]。反应式如图1所示：图1HPCS制备反应原理[9]Fig1ReactionPrincipleofHPCS1.2.2HPCS的定型鉴定采用碘仿反应进行定性鉴定：碘仿反应是指某些含有特殊基团的有机化合物与次碘酸盐作用产生淡黄色碘仿的反应，这类有机化合物中含有CH3CH(OH)-R或者CH3CO-连于H或C上的结构[10]。在试管中加入适量的HPCS溶液，再加入3~5滴I2-KI试液，缓慢振荡至均匀，逐滴加入10%的NaOH溶液，直到溶液呈浅黄色时停止滴加，碱性条件下I2-KI能与羟丙基团[-CH2CH(OH)CH3]发生呈色（浅黄色）反应，若不显色则溶液中不存在羟丙基团。1.2.3丙二醇标准曲线测定制备1.00mg/mL的1-2丙二醇标准溶液。分别吸取2mL、4mL、6mL、8mL、10mL此标准溶液于50mL容量瓶中，蒸馏水稀释至刻度，得到浓度依次为40ug/mL、80ug/mL、120ug/mL、160ug/mL、200ug/mL标准溶液。分别取上述5种标准溶液1.00mL于25mL具塞比色管中，冰水浴下缓慢加入8mL浓硫酸，混合均匀后于100℃水浴加热3min，立即放入冰浴中冷却，小心沿管壁加入3%茚三酮溶液，立即摇匀，25℃水浴10min，在用浓硫酸稀释至刻度，倾倒混匀（切记不要振荡，以免发生危险）。静置5min，用1cm比色皿于595nm处测定吸光度值，作出吸光度-浓度曲线。1.2.4取代度（DS）的测定称取适量HPCS于50mL容量瓶中，加入25mL1mol/L的H2SO4溶液，置于沸水浴中加热至样品溶解成透明溶液，冷却，蒸馏水定容，用相同方法处理CS。分别准确量取1mL上述CS溶液，HPCS溶液及丙二醇标液（1.2.3所配制）于具塞的25mL比色管中。将比色管插入水中，小心加入浓硫酸8mL混匀，拧紧管塞，沸水浴加热3min，立即置于冰浴冷却10min，准确量取0.5mL3%茚三酮溶液，沿管壁加入，振荡均匀，25℃水浴中恒温100min使之显色，然后用浓硫酸定容，分光光度计在595nm下测定吸光度A。以丙二醇用量-吸光度作标准曲线，根据公式计算取代度，计算式如下：（1）（2）式（1）中羟丙基%由式（2）中计算而得；式（2）中ρ（丙二醇）为吸光度A所对应的丙二醇质量浓度μg/mL；m为羟丙基壳聚糖质量g；0.7763为丙二醇转换成羟丙基的转换值[11]。1.2.5红外光谱分析分别称取少量充分干燥后的CS和HPCS固体粉末，KBr压片，中红外光谱仪测定，波数为0~4000cm-1。2结果与讨论2.1HPCS定性检测2.1.1碘仿反应结果本实验通过对产物溶液中滴加I2-KI试液和10%NaOH溶液（两者可结合成次碘酸钠），产生了少量淡黄色的沉淀物，说明发生了碘仿反应，即产物中存在着[-CH2CH(OH)CH3]结构，而反应物原料壳聚糖中不存在伯羟基，可以定性证明生成了HPCS产物。2.1.2FTIR测试结果傅立叶变换中红外测定CS与HPCS，红外分析结果见图2。图2壳聚糖与羟丙基壳聚糖的红外光谱Fig2FTIRpictureofCS&HPCS图2为HPCS和CS的FTIR叠加谱图，a、b均在3400cm-1处存在强的-OH和N-H叠加的伸缩振动吸收峰，1640cm-1和1585cm-1处的N-H变形振动吸收峰几乎没有发生变化。b图中，2968cm-1和1480cm-1处出现了极为明显的新吸收峰，这两处分别是-CH3的伸缩振动和不对称形变，证明在CS上引入了羟丙基基团，羟丙基取代后引入了大量的甲基。同时，位于1000～1200cm-1范围内的吸收峰有不同程度的减弱或消失。1095cm-1处出现典型的醚键，说明反应没有发生在-NH2上，而是在C6上。2.2HPCS羟丙基取代率及产量2.2.1丙二醇标准曲线图3丙二醇标准曲线Fig3Standardcurveofpropanediol根据1.2.3实验操作，绘出如图3所示丙二醇标准曲线，线性方程为Y=0.0043X+0.2040，（R2=0.9957），线性良好。由曲线趋势可知，吸光度值随着丙二醇浓度增大而增大。2.2.2HPCS制备结果本试验采用正交设计实验法，实验设计及主要结果见表1。编号环氧丙烷（mL）反应时间（h）反应温度（℃）HPCS产量（g）取代度（DS）水溶性1104301.88340.0879+--2106452.10510.1568+--3108602.09450.2209+--4204453.40630.4013+++5206603.66200.4224+++6208302.27350.3729++-7304602.71050.3884++-8306302.69820.3156++-9308453.21500.3675++-表1HPCS实验结果Table1ResultoftheexperimentationofHPCS注：---为不溶，+--为少量溶解，++-为大部分溶解，+++为完全溶解根据预实验，以及表1正交设计实验结果可知：环氧丙烷加入量为10mL时，产物HPCS的产量和取代度均比较低，且随体系温度与反应时间变化的增长趋势较小，原因可能由于环氧丙烷加入量不足，导致体系反应活性受限，HPCS生成量以及取代度较低；环氧丙烷取20mL时，HPCS产量明显提高，取代度及相应水溶性也大幅提高，且当反应温度为60℃，反应时间为6h，HPCS平均产量达到3.6620g，平均取代度为0.4224，水溶性良好[12]；环氧丙烷为30mL时，HPCS产量及取代度有下降趋势，可见环氧丙烷加入量过大亦不利于HPCS的生成和取代度的提高。2.2.3反应条件与HPCS取代度的关系根据上述实验结果，分析主要实验条件及因素并进行多次重复实验，可分别获得各反应条件与产物特征指标（取代度）的关系特点，实验结果见图4、5、6。图4HPCS取代度与环氧丙烷反应量的关系Fig4TherelationshipbetweenDSandthereactionvolumeofPO图5HPCS取代度与反应时间的关系Fig5TherelationshipbetweenDSandthereactiontime图6HPCS取代度与反应温度的关系Fig6TherelationshipbetweenDSandthereactiontemperature由图4、5、6可知，反应体系中环氧丙烷的加入量对产物HPCS取代度的影响最大，反应时间和反应温度对其影响相对较小。环氧丙烷加入量较大，时间过长时，产物平均取代度均呈下降趋势，这可能与原料随反应进行而部分损失或挥发有关，当反应温度为60℃时，HPCS平均取代度最大（DS=0.3439）。3结论利用环氧丙烷与壳聚糖反应，制备了水溶性良好的羟丙基壳聚糖，正交设计实验探索了最佳的反应条件及相应的影响趋势。实验结果表明最佳条件为：M壳聚糖：V环氧丙烷：V四甲基氢氧化铵=1：10：0.5，反应时间6h，温度60℃，此条件下制备出的羟丙基壳聚糖平均取代度最高（DS=0.42），且主要反应条件对产物取代度影响关系为：V环氧丙烷>反应温度>反应时间。不足之处为HPCS产量并不与其取代度呈线性关系，原因可能是反应过程中部分原料的挥发所致（环氧丙烷沸点为34℃），且随着反应时间与体系温度的变化，挥发量也不尽相同，从而造成实际反应量不足，近而致使产物的产量下降。因此，获得理想取代度及相应产量的羟丙基壳聚糖，其制备技术和工艺仍需要不断改进和完善。参考文献[1]SzczubialkaK,ZomerskaK,KarewiczA,eta1.Noveldrugcarrierchitosangelmicrosphereswithcovalenttyattachednicotinicacid[J].JournalofControlledRelease,2006,116(2):13-15.[2]XuYM,DuYM.Effectofmolecularstructureofchitosanonproteindeliverypropertiesofchitosannanoparticles[J].InternationalJournalofPharmaceutics,2003,250(1):215-226.[3]PrabaharanM.Chitosanderivativesaspromosingmaterialsforcontrolleddrugdelivery[J].JournalofBiomaterialsApplications,2008,23(1):5-36.[4]居成学,尹建伟,黄凌,等.聚乳酸/羟丙基淀粉复合降解型材料的制备和表征[J].塑料,2008,37(6):67-69.[5]LingK,ZhengF,LiJL,etal.Effectsofsubstitutiondegreeofphotoreactivegroupsonthe