科技支撑计划可行性研究报告提纲

PAGEPAGE12010年南昌市科技支撑计划项目可行性研究报告项目名称：治疗角膜病的汉防己甲素申报单位：南昌弘益科技有限公司（盖章）项目联系人：熊艳君电话13970091856通讯地址：江西省南昌国家高新开发区火炬大街789号邮政编码：330096

治疗角膜病的汉防己甲素可行性研究报告一、选题的必要性（一）项目所处技术领域产业政策本项目是汉防己甲素新的给药途径治疗角膜病创新药物，具有自主知识产权，属于国家《当前优先发展的高技术产业化重点领域》和《国家重点支持的高新技术领域》，是《国家产业结构调整指导目录》、《国家产业技术政策》和江西省“六个一”工程十大战略性新兴产业发展规划鼓励发展的产业和产品。（二）项目所处技术领域的国内外现状和技术发展趋势角膜病是我国的主要致盲眼病之一。角膜疾病主要有炎症、外伤、先天性异常、变性、营养不良和肿瘤等。其中感染性角膜炎症占有重要地位。肺炎球菌较易直接感染角膜，其它病原菌则需要大量局部侵袭或机体抵抗力下降时才易致病。角膜缘血供丰富，角膜周边部和中央部之间在免疫相关的细胞和活性因子的分布上存在显著差异，角膜周边部或角膜缘的淋巴细胞以及补体成分含量高于角膜中央部。此外角膜的周边和角巩缘含有抗原提呈细胞——树突状细胞（表达MHC-II和共刺激分子，能有效的活化T细胞）。周边上皮层和角膜前基质层，存在少量的淋巴细胞。血管黏附分子和细胞因子也可以把血管内不同类别的白细胞吸引到角膜缘。因此，临床上角膜周边部或角膜缘易发生免疫性角膜病（如蚕蚀性角膜溃疡、泡性角结膜炎和边缘性角膜溃疡等），而一些感染性角膜病则易发生于角膜中央区。角膜上皮是抵御病原微生物侵袭角膜的第一道屏障，上皮遭受损伤后，极容易发生感染性炎症。上皮层损伤后可以再生，不留瘢痕。角膜前弹力层受损后不能再生，由上皮细胞或瘢痕组织填充。角膜基质层对维持角膜的透明性及抵抗眼力压有重要作用，损伤后由瘢痕组织修复填补，使角膜失去透明性。角膜后弹力层受损后可以由内皮细胞分泌再生，修复速度为每月10μm，接近正常厚度。内皮细胞的屏障功能遭到破坏后，伤口缘的Descemet's膜收缩并向基质层卷曲，数小时之内，毗邻的内皮细胞向伤口区迁徙，通过细胞重组、增大和迁徙，重建完整的内皮单层结构。当完整的单层内皮细胞重新覆盖Descemet's膜时，细胞间形成接触抑制和稳定的细胞连接。此时，参与创伤修复的细胞体积大于未参与修复区域的细胞。如果内皮损伤较重，局部的内皮细胞会形成复层及纤维化，引起异常的基底膜样物质沉积。角膜是重要的光学通路，角膜病尤其是位于角膜中央的病灶，严重影响视力，所以角膜病要给予积极的治疗。角膜各层对局部使用药物的渗透性不同，脂溶性物质可以迅速通过紧密连接的上皮层，水溶性物质易于通过基质层。因此，为了提高药物眼部使用的生物利用度，理想药物应具备双相溶解性方能穿透角膜进入眼内。角膜移植是重要的复明及治疗手段，角膜免疫学上处于相对的“赦免状态”，角膜的免疫赦免包含以下几种因素：①无血管，免疫效应因子无法输送。②无淋巴管，抗原和抗原提呈细胞无法进入局部淋巴结。③表达免疫抑制因子，包括TGF-β。④表达Fas配体，对活化的淋巴细胞可以诱导Fas介导的凋亡。但角膜仍存在着参与免疫反应的各种成分如T、B淋巴细胞，朗罕氏细胞、免疫球蛋白、补体以及组织相容性抗原等。因此，虽然角膜移植是器官移植中成功率最高的一种。但在某些抗原刺激下，尤其当病变角膜出现新生血管时，角膜移植亦出现免疫排斥反应。因此，药物仍然是治疗角膜病的重要方法。角膜病治愈后遗留厚薄不等的瘢痕。浅层的瘢痕性混浊如云雾状，通过混浊部分仍能看清后面虹膜纹理者称角膜云翳。混浊较厚略呈白色，但仍可透见虹膜者称角膜斑翳。混浊很厚呈瓷白色，不能透见虹膜者称角膜白斑。如果角膜瘢痕组织中嵌有虹膜组织时，使形成粘连性角膜白斑，提示病变角膜有穿破史。若白斑面积大，而虹膜又与之广泛粘连，则可能堵塞房角，房水流出受阻致使眼压升高，引起继发性青光眼。高眼压作用下，混杂有虹膜组织的角膜瘢痕膨出形成紫黑色隆起，称为角膜葡萄肿。角膜斑翳对视力的影响与发生的部位有关，如斑翳在中央部位遮蔽了瞳孔，既使很薄，也严重影响视力，因此必须及时治疗。对角膜斑翳有不少治疗方法，至今仍选择使用的有球结膜下注射高渗水、碘离子导入、狄奥宁和黄降泵软膏局部应用等治疗方法，虽有一定效果，但都不够满意，效疗低，有的操作不便，有的有副作用。角膜斑翳是角膜病治愈后遗留的瘢痕，瘢痕形成时，角膜的吸收功能降低，在这种情况下斑翳也就难以消散。目前，世界上治疗角膜病，特别治疗角膜斑翳方法和药物极为有限，开发有效的治疗药物具有重要的社会意义和经济效益。汉防己甲素又称粉防己碱，是从防己科千金藤属植物StephaniatetrandraS.moore的块根中分离出的主要生物碱，属于双苄基异喹啉类化合物，早期在临床上主要用于治疗早期轻度高血压，亦可用于重症高血压及高血压危象。目前，汉防己甲素在临床上用于抗风湿及抗肿瘤辅助治疗取得较好的疗效，临床应用的剂型有注射液和片剂。近年来的研究证实汉防己甲素是天然的非选择性钙通道阻滞剂，又是钙蛋白的拮抗剂，除了抗炎作用机制外，还可作为有效IL-1阻滞剂而不是花生四烯酸阻滞剂抗眼部炎症反应，甚至其效能超过糖皮质激素，而且，汉防己甲素还通过非竞争性方法显著抑制内毒素，有效用于治疗眼部炎症，包括葡萄膜炎，角膜炎等，以及其导致的视网膜病变。另外，汉防己甲素对白内障、青光眼、视网膜疾病、眼内肿瘤等眼疾病都有一定的药理作用，对眼部炎症、青光眼、增生性玻璃体视网膜病变和视网膜母细胞瘤有良好的治疗作用，但未见汉防己甲素用于角膜病，特别是角膜斑翳的报道。（三）项目技术先进性，对相关领域技术进步的推动作用1、汉防己甲素用于角膜病的机理研究处于国际领先水平研究结果表明，汉防己甲素通过将细胞周期停滞在G0/G1期和诱导细胞凋亡而抑制角膜基质细胞增殖，并能减少纤维连接蛋白在兔角膜基质细胞间的堆积而发挥作用。体外动物实验结果表明，汉防己甲素通过减少TGF-β1的表达和抑制NF-ΚB的活性以及减少细胞外基质（ECM）的生成，对兔准分子激光角膜屈光术（PPK）后角膜上皮下雾状混浊（Haze）形成有明显抑制作用。通过不同浓度汉防己甲素的对比研究，筛选出0.1%浓度汉防己甲素为最低有效浓度；同时，运用描述性毒理学进一步证实0.1%及以下浓度汉防己甲素对兔眼眼组织无刺激性、毒性，应可安全用于眼部，0.3%汉防己甲素为最高耐受浓度，而汉防己甲素在眼部较长时间使用不会引起眼压升高。2、汉防己甲素用于角膜病的药效研究处于国际领先水平研究结果表明，汉防己甲素对细菌性角膜炎、角膜烟曲菌病、痢疾杆菌诱发的角膜炎、角膜斑翳有显著治疗作用。3、汉防己甲素滴眼液药代动力学研究处于国际领先水平采用HPLC法研究汉防己甲素滴眼液在兔眼部的药代动力学，结果表明，汉防己甲素滴眼液单次滴眼后，在泪液中迅速消除；在眼内各组织中，汉防己甲素在角膜中的浓度最大，在角膜中的AUC远远大于其他眼内组织的AUC值，约为房水中的AUC的8倍、虹膜睫状体AUC的5倍、晶体状AUC的15倍、玻璃体AUC的25倍，说明汉防己甲素进入眼内的药物大部蓄积在角膜组织中，进入眼内其他组织的量相对较少。汉防己甲素滴眼液单次滴眼后，在兔眼各组织中的药物浓度变化均符合血管外给药一室模型一级动力学过程。汉防己甲素滴眼液单次滴眼后，在角膜中能达到较高浓度，而且消除速率相对较慢。汉防己甲素在眼部的这种代谢特点为开发治疗角膜病的滴眼液提供了重要依据。本项目研究开发了一种治疗角膜病的创新药物，作为自主创新的经济增长点，对于正确引导我国医药行业药物研究开发，促进产业技术升级和产品结构调整具有积极的作用。（四）项目目前进展情况及市场分析1、项目目前进展情况对汉防己甲素用于角膜病的机理以及治疗角膜炎、角膜斑翳等角膜病的作用进行了探索性研究，并对汉防己甲素眼部用药的药代动力学进行了基础性研究，选择汉防己甲素滴眼液作为治疗角膜病的剂型，开展汉防己甲素滴眼液药学、药理毒性学和药效学研究。2、项目产品市场分析角膜病是我国的主要致盲眼病之一，但治疗方法和药物极其有限。本项目治疗角膜病的汉防己甲素滴眼液具有显著的药物经济学价值和经济社会效益。治疗角膜病的汉防己甲素滴眼液作为具有自主知识产权的创新药物，目前国内外尚未见相关研究和上市报道，亦未见相关专利报道，预计其年销售峰值将达8亿元。二、技术方案论述（一）项目技术关键点或创新点论述，项目完成时达到的技术水平查新报告表明，将检索到的文献资料与本项目的查新点对比分析后得出结论：国内未检索到研发治疗角膜病的汉防己甲素全身用药制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、注射剂；治疗角膜病的汉防己甲素局部用药制剂，包括黏膜给药制剂、贴剂、透皮吸收剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂；以及治疗角膜斑翳的汉防己甲素滴眼液的文献报道。本项目的查新点具有新颖性。1、项目技术创新点论述1.1汉防己甲素用于角膜病作用机理研究结果表明，汉防己甲素通过将细胞周期停滞在G0/G1期和诱导细胞凋亡而抑制角膜基质细胞增殖，并能减少纤维连接蛋白在兔角膜基质细胞间的堆积而发挥作用。体外动物实验结果表明，汉防己甲素通过减少TGF-β1的表达和抑制NF-ΚB的活性以及减少细胞外基质（ECM）的生成，对兔准分子激光角膜屈光术（PPK）后角膜上皮下雾状混浊（Haze）形成有明显抑制作用。通过不同浓度汉防己甲素的对比研究，筛选出0.1%浓度汉防己甲素为最低有效浓度；同时，运用描述性毒理学进一步证实0.1%及以下浓度汉防己甲素对兔眼眼组织无刺激性、毒性，应可安全用于眼部，0.3%汉防己甲素为最高耐受浓度，而汉防己甲素在眼部较长时间使用不会引起眼压升高。药效研究结果表明，汉防己甲素对细菌性角膜炎、角膜烟曲菌病、痢疾杆菌诱发的角膜炎、角膜斑翳有显著治疗作用。1.2治疗角膜病的汉防己甲素全身用药制剂，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、注射剂。1.3治疗角膜病的汉防己甲素局部用药制剂，包括眼部给药制剂、黏膜给药制剂、贴剂、透皮吸收剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂。1.4汉防己甲素滴眼液处方及制备工艺。1.5治疗角膜病的汉防己甲素滴眼液采用HPLC法研究汉防己甲素滴眼液在兔眼部的药代动力学，结果表明，汉防己甲素滴眼液单次滴眼后，在泪液中迅速消除；在眼内各组织中，汉防己甲素在角膜中的浓度最大，在角膜中的AUC远远大于其他眼内组织的AUC值，约为房水中的AUC的8倍、虹膜睫状体AUC的5倍、晶体状AUC的15倍、玻璃体AUC的25倍，说明汉防己甲素进入眼内的药物大部蓄积在角膜组织中，进入眼内其他组织的量相对较少。汉防己甲素滴眼液单次滴眼后，在兔眼各组织中的药物浓度变化均符合血管外给药一室模型一级动力学过程。汉防己甲素滴眼液单次滴眼后，在角膜中能达到较高浓度，而且消除速率相对较慢。汉防己甲素在眼部的这种代谢特点为开发治疗角膜病的滴眼液提供了重要依据。2、项目完成时达到的技术水平治疗角膜病的汉防己甲素制剂，特别是汉防己甲素滴眼液达到国际领先水平。（二）项目技术方案论述1、药学研究1.1处方、工艺研究（1）制剂规格的确定根据本项目前期研究结果，确定汉防己甲素滴眼液的浓度分别为0.1%和0.3%，制剂规格分别为5ml：5mg和5ml：15mg。（2）处方筛选以汉防己甲素的溶解度、稳定性和药理活性为指标，确定溶液的最佳pH值。通过稳定性试验筛选渗透压调节剂、缓冲剂、抗氧剂、防腐剂和黏度剂的种类与用量，进行渗透压调节，并结合眼刺激性试验和药效学研究，确定处方。①酸的筛选汉防己甲素为双苄基异喹啉类生物碱，不溶于水，与酸形成可溶性盐可改善其溶解度，分别对不同的酸及加入量进行筛选，在100℃②渗透压调节剂的筛选常用的渗透压调节剂有氯化钠、葡萄糖和甘露醇，分别按上述酸的加入量，用0.65%氯化钠、5%葡萄糖和5%甘露醇做渗透压调节剂，用10%氢氧化钠调节溶液的pH值为6.0，在100℃③缓冲剂的筛选为保证溶液的稳定性，分别用适合眼用的磷酸盐、硼酸-硼砂、硼酸-醋酸钠为缓冲剂，调节溶液的pH值为6.0，在100℃④溶液的pH值眼睛耐受的pH值范围为5～9，pH值过高或过低都会对眼睛产生刺激性。汉防己甲素为生物碱，pH值大于7.5时有游离碱析出，溶液浑浊，所以可筛选的pH值范围为5.0～7.0。按上述方法分别配制pH5.0、6.0、6.5和7.0的溶液，在100℃⑤抗氧剂的筛选适合pH值为6.0的眼用抗氧剂有维生素C、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和乙二胺四乙酸二钠，常用量分别为0.02%～0.5%、0.1%～0.2%、0.025%～0.1%和0.01%～0.1%。考虑到维生素C氧化变色，所以不选用，重点考察亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和乙二胺四乙酸二钠，用量分别为0.2%、0.3%和0.03%，用10%氢氧化钠调节溶液pH值为6.0，在100℃⑥防腐剂的筛选适合pH为6.0的眼用防腐剂有苯扎氯铵和尼泊金乙酯。尼泊金乙酯在282nm波长处有强吸收，干扰汉防己甲素的含量测定。因此选用苯扎氯铵为防腐剂，并对其用量进行筛选。用量分别为0.01%、0.015%和0.02%，调节溶液的pH值为6.0，在100℃⑦黏度剂的选择常用的眼用黏度剂有羟丙甲纤维素、聚乙烯吡咯烷酮K30。按照眼用黏度剂的常用量，用10%氢氧化钠调节溶液pH值为6.0，在100℃⑧渗透压调节采用渗透压测定仪测量渗透压，调整渗透压调节剂的加入量，使为等渗（286mOsmol/kg）。（3）制备工艺研究①主药和辅料的粉碎及粒径验证。②溶液的配制方法研究验证。③溶液的pH值、渗透压调节方法研究验证。④溶液的无菌处理方法研究验证。⑤半成品控制方法研究验证。（4）影响因素试验采用确定的处方、工艺制备的样品，灌装于聚酯滴眼液瓶中，分别在光照（4500LX）和高温（40℃、60（5）冻融试验为考察在运输或使用过程中温度对产品质量的影响，模拟药品在运输和使用过程中可能遇到的温度条件，考察采用拟上市包装的样品的稳定性。采用确定的处方、工艺制备的样品，灌装于聚酯滴眼液瓶中，热循环三次，每次在-20℃～-10℃2天、然后在401.2中试放大生产研究按照处方、工艺研究结果，进行中试放大生产研究，进一步考察中试放大规模条件下的工艺技术参数，制备中试放大样品。1.3工业化生产研究验证根据中试放大生产研究结果，进一步在工业化生产条件下对厂房、设备、处方、工艺、清场清洁等进行验证，工业化生产产品。1.4质量研究根据本品的理化特性，按照中国药典2010年版二部附录IG眼用制剂滴眼剂和中国药典2010年版二部附录XIXA药品质量标准分析方法指导原则的规定，参照《化学药物制剂研究基本技术指导原则》（【H】GPH4-1）、《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》（【H】GPH5-1）、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》（【H】GPH1-1）的要求，对汉防己甲素滴眼液的外观性状、鉴别、可见异物、pH、装量、渗透压摩尔浓度、无菌、含量均匀度、杂质和含量测定分析控制方法进行研究验证，并对产品质量进行分析检测，为制定产品质量标准提供依据。1.5稳定性研究根据本品的理化特性，按照中国药典2010年版二部附录XIXC原料药与药物制剂稳定性试验指导原则的规定，参照《化学药物稳定性研究技术指导原则》（【H】GPH6-1）的要求，以外观、有关物质、pH和含量为指标，考察采用拟上市包装的样品加速试验（40℃，RH75%）6个月和长期试验（252、药理毒理研究已上市的汉防己甲素剂型为注射剂和片剂，适应症为抗风湿药及抗癌增效药。治疗角膜病的汉防己甲素滴眼液属于增加新适应症、改变给药途径、改变已上市销售的制剂剂型的化学药品第1类新药，是局部用药制剂，根据《药品注册管理办法》的规定，进行汉防己甲素滴眼液治疗角膜病的相关主要药效学和非临床安全性研究。2.1主要药效学研究（1）汉防己甲素滴眼液对细菌性角膜炎的作用用金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌标准菌株感染新西兰白兔，制成细菌性角膜炎动物模型，用比浊法测定细菌数，用生理盐水为对照，观察给予汉防己甲素滴眼后兔外眼形态学和角膜上细菌生长情况。（2）汉防己甲素滴眼液对角膜烟曲菌病的治疗作用角膜划痕后板层内注射致角膜烟曲菌病。将烟曲菌悬液（106/ml）0.1ml注入新西兰白兔一只眼角膜基层内，至4mm区域水肿混浊为止，另一只眼以同法注入生理盐水作为对照，制成角膜烟曲病动物模型，给予汉防己甲素滴眼液和0.25%氯霉素滴眼液，每日用裂隙灯观察其角膜、前房、虹膜及晶体等变化，动物接种后分别于1、2、4、6、8、10、15、20、25及30天采用耳静脉注射空气法处死，立即取材制备组织学标本。电镜标本仅限于1、2、4、6及8天者，同时取正常及对照眼角膜检查。取材后，将角膜组织于Carnoy液中固定12小时，石蜡包埋，HE染色，用光镜观察。取材后，立即将角膜置入2.5%戊二醛液中固定2小时，然后切成4mm×5mm组织块，经梯度乙醇脱水、临界点干燥及真空喷镀金膜后用扫描电镜观察。将角膜组织于2.5%戊二醛液中固定2小时，切成2mm×3mm小块，1%四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，半薄切片定位后超薄切片，柠檬酸铅及醋酸铀双重染色后于透射电镜下观察，评价汉防己甲素滴眼液对角膜烟曲菌病的治疗作用。（3）汉防己甲素滴眼液对痢疾杆菌诱发的角膜炎的作用将有毒痢疾菌株的新鲜斜面培养物制成一定浓度的盐水菌悬液，滴入豚鼠角膜结合膜囊内，制成痢疾杆菌感染实验动物模型，用生理盐水作为对照，观察汉防己甲素滴眼液对痢疾杆菌诱发角膜炎的作用。（4）汉防己甲素滴眼液对角膜斑翳的治疗作用取经视力检查、角膜内皮细胞形态和密度检查、角膜地形图检查、裂隙灯检查、A超检查确定为角膜斑翳模型豚鼠，用汉防己甲素滴眼液每天3～6次，连续30天，用狄奥宁软膏为对照。观察汉防己甲素滴眼液对角膜斑翳的治疗作用。2.2非临床安全性研究（1）眼刺激性试验以新西兰白兔眼为动物模型，对汉防己甲素滴眼液的眼刺激性进行试验。在体法用眼刺激性实验评价眼刺激性，评价汉防己甲素滴眼液单次给药或重复给药的眼刺激性；离体法用角膜水化值为评价指标，汉防己甲素滴眼液重复多次给药角膜水化值的变化，对角膜的刺激性。（2）溶血性试验取兔血，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入生理盐水，摇匀，离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水洗涤至上清液不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水制成2%的混悬液，供试验用。取汉防己甲素滴眼液作为供试品溶液；以生理盐水为阴性对照，以蒸馏水为阳性对照，依次加入2%红细胞悬液，立即置37℃±0.5℃2.3过敏性试验（1）眼部被动过敏试验用兔，用汉防己素滴眼液作为供试液，以牛血清白蛋白为阳性对照，以汉防己素滴眼液辅料生理盐水溶液（除无汉防己素外，其它辅料和用量与汉防己素滴眼液相同）为阴性对照，腹腔注射制备抗血清。用生理盐水稀释抗体血清，滴入兔眼，进行被动致敏。被动致敏48小时后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的1%伊文思兰染料共1ml，进行激发。30分钟后麻醉处死各组动物，观察兔眼组织变化，评价汉防己素滴眼液的过敏情况。（2）全身主动过敏试验用豚鼠，用汉防己素滴眼液作为供试液，以牛血清白蛋白为阳性对照，以汉防己素滴眼液辅料生理盐水溶液（除无汉防己素外，其它辅料和用量与汉防己素滴眼液相同）为阴性对照，隔日一次腹腔注射，共3～5次，致敏。在末次注射后第14天快速静脉注射给药激发，激发剂量为致敏剂量的3～5倍。致敏期间每日观察动物的症状。初次、最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重。静脉注射激发立刻至30分钟，详细观察每只动物的过敏反应症状，症状出现及消失时间。最长观察3小时。判断过敏反应发生程度。计算过敏反应发生率。根据过敏反应发生率和发生程度进行综合判断。评价汉防己素滴眼液的全身主动过敏情况。（3）光过敏反应试验用白色豚鼠，设阳性对照和阴性对照组。眼内滴入受试物，照射紫外线，每日操作一次，连续5日进行致敏，7～10天后，再次眼内滴入受试物，照射紫外线进行激发。评价汉防己素滴眼液的光过敏反应。2.4汉防己甲素滴眼液非临床药代动力学研究用微量注射器给新西兰白兔双眼结膜囊内滴入50μl0.5%汉防己甲素滴眼液，轻轻闭合双睑约1min，滴眼后分别于0.167、0.5、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3.0、4.0和12.0h耳缘静脉栓塞处死动物，用生理盐水冲洗结膜囊，立即抽取房水，取角膜组织，并用滤纸吸干后称重。所有样品均储存于-20℃（1）角膜样品的处理取兔眼角膜，生理盐水冲洗表面，吸干水分，称重，将角膜剪碎，加甲醇0.8ml，匀浆，漩涡混合3min，15000r·min-1离心20min，取上清液作为检测液。（2）房水样品处理取房水200μl，加入甲醇200μl，漩涡混合3min，15000r·min-1离心20min，取上清液作为检测液。（3）角膜和房水中汉防己甲素浓度分析检测方法研究验证采用RP-HPLC法检测角膜和房水中的汉防己甲素浓度，用甲醇沉淀蛋白质。对分析检测方法的线性、准确性、精确性、耐用性、最低检测限进行研究验证，建立汉防己甲素在角膜和房水中的分析检测方法。（4）药代动力学参数测定测定汉防己甲素在兔眼角膜组织及房水中达峰时间、峰浓度、消除速率常数、吸收速率常数、清除半衰期、曲线下面积、泪液转移率、泪液的初始药物浓度，计算角膜上皮药物的渗透系数，评价汉防己甲素在角膜组织与房水中药物浓度变化的动力学模型、在角膜组织中的渗透性、在房水中的浓度变化过程，为制定临床研究方案提供依据。3、临床研究3.1临床药代动力学研究男性健康志愿者，采用LC-MS/MS分析检测技术，测定汉防己甲素在人体眼角膜组织及房水中达峰时间、峰浓度、消除速率常数、吸收速率常数、清除半衰期、曲线下面积、泪液转移率、泪液的初始药物浓度，计算角膜上皮药物的渗透系数，评价汉防己甲素在人体角膜组织与房水中药物浓度变化的动力学模型、在人体角膜组织中的渗透性、在房水中的浓度变化过程，为临床研究提供依据。3.2临床研究（1）I期临床试验采用剂量递增方案，在人体（主要是健康志愿者）进行不同剂量给药，考察人体对汉防己甲素滴眼液的耐受性，找出人体可耐受的剂量，了解在此剂量下的不良反应，为II期临床研究推荐合适的剂量。（2）II期临床试验采用随机、双盲、多中心、安慰剂对照试验方法，评价汉防己甲素滴眼液两个剂量组治疗角膜病的安全性和有效性，为III期临床研究验证推荐剂量。（3）III期临床试验采用随机、双盲、多中心、安慰剂对照试验方法，用II期临床试验推荐的剂量，验证汉防己甲素滴眼液治疗角膜病的安全性和有效性，为临床应用提供依据。（三）项目技术质量指标1、项目产品达到的主要技术性能指标1.1对眼部炎症、青光眼、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜母细胞瘤、角膜病，特别是角膜斑翳有良好的治疗作用。1.2汉防己甲素滴眼液成品率97%，汉防己甲素滴眼液含量大于95%，杂质含量小于1.5%。1.3汉防己甲素滴眼液眼部给药安全有效，质量可控。2、项目产品执行的质量标准：国家药品质量标准。3、通过的国家相关行业许可认证：汉防己甲素滴眼液通过药品GMP认证，取得《药品GMP证书》。（四）分阶段描述项目执行过程中各阶段目标1、临床前研究1.1时间：2010年1月～2011年12月1.2目标：获得国家食品药品监督管理局申请临床研究注册《受理通知书》。2、临床研究2.1时间：2013年6月～2014年12月2.2目标：（1）获得国家食品药品监督管理局批准进行临床研究，完成临床研究。（2）获得国家食品药品监督管理局申请生产注册《受理通知书》。3、产业转化3.1时间：2015年1月～2015年12月3.2目标：（1）获得国家食品药品监督管理局批准，取得《新药证书》和《注册批件》。（2）通过药品GMP认证，取得汉防己甲素滴眼液《药品GMP证书》。（五）项目经费预算情况项目总投资2540万元。已完成投资80万元，用于汉防己甲素滴眼液制剂、作用机理、药效、药代动力学研究。1、本项目须新增投资2460万元，其投资构成和投资预算如下：1.1项目研究、注册等费用（1）药学研究费用：包括处方工艺研究、质量研究、稳定性研究、样品小试、中试和工业化生产等费用120万元。（2）药理毒理研究费用：160万元。（3）非临床药代动力学研究费用：50万元。（4）临床药代动力学研究费用：60万元。（5）临床研究费用：1000万元。（6）申请临床研究注册复核检验和注册审批费用：10万元。（7）申请生产注册复核检验和注册审批费用：30万元。（8）知识产权费用：5万元。（9）其他费用：包括项目技术咨询、成果鉴定、学术交流、会议、差旅费、劳务费、管理等费用50万元。小计：1485万元。1.2项目生产车间建设工程费用建设1000M2（1）土建工程费用：200万元。（2）通风、空调、消防、净化安装、装修工程费用：500万元。小计：700万元。1.3项目生产设备、分析检测仪器采购费用（1）生产设备采购费用①溶液配制系统3套：30万元。②溶液过滤系统3套：90万元。③溶液灌装系统2套：60万元。（2）分析检测仪器采购费用①液相色谱仪1套：35万元。②气相色谱仪1套：50万元。小计：265万元。1.4药品GMP认证费用：10万元。合计：2460万元。2、科技经费使用预算序号科目申报经费1设备、仪器购置费202材料、样品加工费503测试化验加工费504资料、调研费55燃料动力费56技术合作与交流费1507出版/文献/信息传播/知识产权事务费58专家咨询费59鉴定或验收费2010管理费1011其他合计320三、项目实施支撑条件（一）项目技术来源及知识产权情况本项目汉防己甲素制剂技术及其治疗角膜病的用途均为自有技术，均具有自主知识产权（专利申请号：200910186826.0）。（二）项目实验、检测等外部配套条件1、已建有原料药和制剂小试实验室、中试工程技术研究中心。2、已建有制剂生产水、电、汽、环保、仓储等辅助设施。3、已建有理化分析、光谱分析、色谱等分析检测中心，配有红外光谱、紫外-可见光谱等分析检测仪器。（三）项目申请单位人才资源情况1、项目单位主要负责人朱丹基本情况朱丹，女，1952年7月21日出生，毕业于中国药科大学，高级工程师。曾任解放军186医院药剂科药师、江西省药品检验所主管药师，制剂工艺和药品质量研究为其专长，并负责新药药代动力学和临床研究。以朱丹为首的科研团队通过不断创新共获得国家药品监督管理局批准的新药30个，批准进行临床研究的新药8个，已经申请注册和在研新药12项；申请发明专利116项。荣获南昌市五一劳动奖章、南昌市科技进步二等奖、江西省技术发明三等奖。2、项目主要负责人刘孝乐基本情况刘孝乐，男，1962年10月1日出生，大学学历，药学专业，高级工程师，是南昌弘益科技有限公司总经理，国家创新型试点企业、国家知识产权试点企业、江西省创新型试点企业、江西省知识产权试点企业技术创新负责人。刘孝乐同志近5年专业方面获奖情况：（1）2005年被评为江西省科技创业十佳领军人物。（2）2006年被评为南昌市十大杰出创新青年企业家。（3）2007年、2008年被评为南昌高新区创新先进个人。（4）2007年获中国民营科技发展贡献奖。（5）2007年南昌市科技进步二等奖项目负责人。（6）2008年江西省技术发明三等奖项目负责人。（7）2008年江西省优秀科技新产品奖（6项）项目负责人。（8）2008年江西省优秀新产品二等奖项目负责人。（9）2008年江西省优秀新产品三等奖项目负责人。（10）2008年南昌市优秀新产品二等奖项目负责人。（11）2008年南昌市优秀新产品三等奖项目负责人。（12）2008年南昌市“521”（13）2008年享受南昌市政府特殊津贴。3、项目研发负责人高永良基本情况高永良，男，1951年出生，现任南昌弘益科技有限公司首席研发专家，毕业于中国药科大学，曾任军事医学科学院毒物药物研究所制剂研究室主任，研究员（教授），博士生导师，主要研究领域为药剂学。先后主持并完成了7个国家新药品种研究，已获新药证书6个，申报发明专利18项，其中5项新药成果和专利已转化生产，取得的经济效益逾48亿人民币。获奖研究成果有六项。作为第一署名的获军队科技进步二等奖3项和家科技进步三等奖1项；第二署名省科学技进步奖一等和二等奖各1项。已培养硕士研究生36名，博士研究生6名。担任全国药学会制剂专业委员会委员，国家、北京市、全军新药审评委员，全军药学会药剂专业委员会主任委员，国家发改委药品价格评审专家，国家863项目评审专家。1993年获“全国首届中国青年医学科技之星”称号。1994年享受国务院特殊津贴。1995年获“吴阶平—保罗杨森医药研究奖”制剂学科一等奖和光华科技基金三等奖，“2000年中国药学发展奖”（药剂学奖）获得者。其事迹和突出贡献，先后被人民日报、解放军报、健康报、中央电视台等新闻媒介报道。2009年被提名为中国工程院院士候选人。4、项目技术负责人钱进基本情况钱进，女，1948年6月26日出生，大学学历，药学专业，高级工程师，主持阿莫西林钠与克拉维酸钾复合制剂等20项新药研究开发工作，并已获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书，取得了良好的社会效益和经济效益。获得中国专利优秀奖、江西省科学技术进步二等奖，江西省科技技术进步三等奖、江西优秀重点新产品奖、江西省医药科技进步二等奖，江西技术发明三等奖、第十二届上海经济区医药情报网年会三等奖。荣获南昌市科技进步二等奖、江西省技术发明三等奖。5、项目申报单位技术人员总数、中高级技术人员比例项目申报单位南昌弘益科技有限公司现有员工136人，其中技术人员98人，占员工总数的72%；高级技术人员占员工总数的12%，中级技术人员占员工总数的23%。（四）项目组人员专业结构、职称结构序号姓名性别出生日期职称职务学历专业1钱进女1948.6高级工程师总工程师大专药学2高永良男1951.11研究员首席研发专家学士药学3朱丹女1952.7高级工程师董事长学士药学4刘孝乐男1962.10高级工程师课题总师大学药学5穆正义男1953.6高级工程师技术总监学士药学6朱晓洪男1953.3主任药师工程中心副主任学士药学7李劲彤男1971.2研究员博士医学8叶英女1964.11研究员首席科学家博士药学9陶琳女1981.1工程师药研所副所长学士药学10赵银鹰女1959.10高级工程师副总工程师学士药学11蒋俊超男1986.10助理工程师学士药学12黄国琴女1987.5技术员药学13方丹丹女1986.7技术员药学14章和清男1979.1助理工程师车间主任助理药学15赵岩女1984.10助理工程师学士生物16章勇男1986.5技术员药学（五）项目新增投资筹集情况项目新增投资2460万元全部由项目申报单位自筹，其中申请银行贷款1130万元。四、项目预期经济效益（一）预期市场需求角膜病是我国的主要致盲眼病之一，但治疗方法和药物极其有限。本项目治疗角膜病的汉防己甲素滴眼液具有显著的疗效和安全性，填补角膜病治疗药物市场空白，具有显著的药物经济学价值和经济社会效益。治疗角膜病的汉防己甲素滴眼液作为具有自主知识产权的创新药物，目前国内外尚未见相关研究和上市报道，亦未见相关专利报道，预计其年销售峰值将达8亿元。（二）预期盈利水平以下按年产销500万支汉防己甲素滴眼液分析经济效益（1）成本：每3.37元/支：①药材、辅料费用：1.03元/支；②包装材料费用：1.34元/支；③制造费用：每粒1.00元；（2）销售价格：12元/支（3）税金：1.54元/支①每支应缴增值税=[(12÷1.17)×17%]-[(1.03+1.34)÷1.17×17%=1.40元/支②每支应缴附加税=1.40×(7%+3%)=0.14元/支（4）项目达产时财务分析：①年销售额=500万支×12元/支=6000.00万元②年销售利润=销售额-成本-税金=6000.00万元-（3.37元×500）-(1.54元×500)=6000.00万元-1685.00万元-770.00万元=3545.00万元（5）三项费用（管理费用、销售费用、财务费用）=6000.00×25%=1500.00万元（6）净利润：3545.00-1500.00=2045.00万元（7）投资利润率=利润÷投资额=2045.00÷2540.00=80.51%。（8）利税率=利税总额÷投资额=(2045.00+770.00)÷2540.00=110.82%（9）投资回收期(不含建设期)=投资额÷年现金净流量=2540.00万元÷2045.00万元/年=1.24年（三）预期产业化前景1、汉防己甲素用于角膜病的机理研究为本项目奠定了基础研究结果表明，汉防己甲素通过将细胞周期停滞在G0/G1期和诱导细胞凋亡而抑制角膜基质细胞增殖，并能减少纤维连接蛋白在兔角膜基质细胞间的堆积而发挥作用。体外动物实验结果表明，汉防己甲素通过减少TGF-β1的表达和抑制NF-ΚB的活性以及减少细胞外基质（ECM）的生成，对兔准分子激光角膜屈光术（PPK）后角膜上皮下雾状混浊（Haze）形成有明显抑制作用。通过不同浓度汉防己甲素的对比研究，筛选出0.1%浓度汉防己甲素为最低有效浓度；同时，运用描