义翘讲堂《高质量重组蛋白制备策略与方法》

北京义翘神州科技股份有限公司高质量重组蛋白制备策略与方法CONTENT义翘神州简介1重组表达技术平台2重组蛋白表达和纯化策略3总结4义翘神州义翘神州简介01义翘神州CompanyOverview硬件设施:~29,000m2超过27,100平米的研发生产中心超过1,900平米的洁净生产车间我们的客户:6,000+产品与服务已推广至全球90多个国家地区，涵盖全球Top20生物制药企业、生物科技公司、诊断试剂公司、科研院所、知名大学、顶级医院等人才队伍:770+硕士及以上学历人才：130+现货产品:52,000+硕士及以上学历人才：130+北京义翘神州主要从事生物试剂研发、生产、销售并提供技术服务,主要业务包括重组蛋白、抗体、基因和培养基等产品以及重组蛋白、抗体的开发和生物分析检测等服务。公司概况义翘神州CompanyOverview领先的技术平台全方位的技术能力分子构建细胞培养蛋白纯化动物免疫抗体筛选规模化生产质量检测完善的蛋白表达技术平台领先的抗体开发技术平台四大蛋白表达体系多样化的抗体开发技术义翘神州CompanyOverview完善的质量控制体系UVSDS-PAGESEC-HPLCMALS内毒素理化类检测技术价值数千万的理化检测仪器，可提供蛋白、抗体等的含量、纯度、内毒素、高级结构以及LC、MS、HPLC、N端测序等相关检测。BiacoreFlowCytometryIP/Co-IPIFIHCWesternBlotELISAOctet免疫学检测技术义翘神州建立了全面的免疫学检测平台，可分别从组织水平、蛋白/抗体分子水平、细胞水平等进行免疫学检测。功能性活性评估技术义翘神州已建立近300种配体受体检测模型、400+蛋白活性检测方法，可用于包括结合活性评估、多种酶、激酶的体外活性评、细胞活性评估等。1.结合活性：基于配体受体结合的蛋白ELISA水平和生物大分子相互作用分析。2.细胞活性：基于蛋白抗体本身功能，可在细胞水平评价其对细胞的增殖、抑制、分化、黏附、趋化、分泌、凋亡及抗体的ADCC、CDC等作用。结合活性检测抗体活性评价酶、激酶活性检测细胞因子活性检测假病毒中和检测血凝活性检测全面的质量体系认证先进的检测设备义翘神州CompanyOverview多种试剂类型，可应用于多个研究领域自主研发生产现货供应生物试剂可应用于6,500+重组蛋白14,000+抗体32,000+基因GMP级别核酸酶无血清细胞培养基600+试剂盒诊断试剂开发免疫学研究大分子药物研究疫苗开发结构生物学研究表观遗传学干细胞研究心血管研究细胞生物学神经生物学研究肿瘤研究病毒研究义翘神州CompanyOverview覆盖基因、蛋白、抗体领域，从研发到生产、检测的“一站式”技术服务CRO服务抗体制备服务重组抗体生产服务重组蛋白表达服务ELISA试剂盒开发服务免疫检测服务生物安全检测服务生物检测服务过表达细胞系构建服务亲和力检测服务免疫印迹(WesternBlot)检测服务免疫组化(IHC)/免疫荧光(IF)单染检测服务多重染色服务HE染色及特殊染色服务流式细胞(FCM)检测服务ELISA检测服务IP/Co-IP技术服务病毒灭活/清除验证服务细胞库检测服务最快12天即可完成从基因合成到100mg真核蛋白表达的开发和生产义翘神州重组表达技术平台02义翘神州蛋白质是生命之本IntrotoRecombinantTechnologies/about-nci/organization/ccg/blog/2020/intro-proteogenomics-central-dogma/chemistry/protein-structure-and-levels-of-protein/分子生物学中心法则TransportRegulationCNSRegenerationCatalystFluidbalanceSignallingImmunityStructuralproteinsMobility蛋白质：生命活动的直接执行者义翘神州重组表达技术核心概念重组蛋白的应用生物药结构生物学研究细胞培养天然vs重组蛋白天然蛋白重组蛋白丰度丰度低无丰度限制动物源有无动物源产率低高批间差高可控andsomuchmore…工业酶催化生物材料药物开发诊断试剂IntrotoRecombinantTechnologies义翘神州重组表达技术关键因素表达载体（质粒）

线性双链DNA分子

启动子：基因转录起始处MCS：插入目的基因

抗性基因：辅助筛选宿主细胞HEK293/CHOInsectcellE.coliYeast分泌表达蛋白或抗体，天然PTM，正确折叠较长培养周期，成本相对较高可溶蛋白，高密度培养，正确折叠和一定的PTM

糖基化糖链较短，成本相对较高低成本，表达快速，易放大无PTM,包涵体，重组表达蛋白分子量上限相对较低低成本，表达快速，易放大高度mannose糖基化PTM*PTM=翻译后修饰，包括糖基化，磷酸化，乙酰化等纯化方法（柱层析）

蛋白质/抗体的理化性质决定纯化方案的设计

蛋白关键理化指数：纯化标签（i你和层析），分子量（蛋白大小），等电点（电性电势分布），疏水性…

常用纯化介质：亲和，离子交换，分子筛，疏水层析，吸附层析，反向…/chemistry/differential-extraction-chromatography/IntrotoRecombinantTechnologies义翘神州目的基因导入E.coilandyeast化学转化(E.coli)电转化(E.coli,yeast)昆虫细胞-杆状病毒介导基因导入哺乳动物细胞-稳转细胞系构建IntrotoRecombinantProteins义翘神州哺乳动物细胞（瞬时转染）M1+T1M1+T2M2+T2M2+T2M1+T2WeakGFP+StrongGFP+配套试剂适配程度决定哺乳动物细胞瞬时转染表达效率HEK293FTDG44SBICompetitor提高抗体表达量

选择20株低表达量抗体(<20mg/L)

通过使用不同培养基配方和转染试剂排列组合优化培养条件选择两代培养基(M1andM2)

选择两种配比转染试剂(T1andT2)

相同培养体积，培养周期和温度一步ProteinA亲和纯化抗体目的基因导入IntrotoRecombinantTechnologies义翘神州重组蛋白表达和纯化策略03义翘神州重组表达策略制定CaseStudies:RecombinantExpressionProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructHost,construct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最终应用决定表达和纯化策略义翘神州构建设计方案截去影响蛋白表达的区段Construct1Construct2

单次跨膜蛋白胞外区(MW=~90KDa)

昆虫细胞表达

纯化分泌蛋白

删去N端高疏水区促进蛋白分泌表达功能区域串联表达Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重组人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域复合酶昆虫细胞表达纯化胞内蛋白

通过功能区串联获得高产重组蛋白CaseStudies:RecombinantExpression义翘神州宿主细胞对重组表达的影响

重组表达新冠NP蛋白(MWofmonomer=~45KDa)

首先使用昆虫细胞进行表达尝试，后使用不同的E.coli菌株进行蛋白表达

选取适合的E.coli表达菌株可促进蛋白的表达和纯化Oligomer=34%BufferoptimizedOligomer=50%昆虫细胞表达SwitchhostE.coli

菌株1E.coliMW:~330kDaLot1Lot1,FTx3Ye,

Q,.etal.ProteinSci.

2020,29:1890–1901.

DOI:10.1002/pro.3909Kang,S.,etal.,ActaPharmaceuticaSinicaB,DOI:10.1016/j.apsb.2020.04.009E.coli

菌株2CaseStudies:RecombinantExpression义翘神州分子伴侣的使用“通用型”分子伴侣DimmercontentNochaperone0hr,~8%dimmer

目标蛋白需形成同源二聚体方可确保活性正确HEK293细胞表达

纯化分泌蛋白

使用通用型分子伴侣促进蛋白正确折叠和组装MonomerDimmerMonomerDimmerDimmerNochaperone48hr,~25%dimmerW/chaperone0hr,~95%dimmer116.066.245.035.00hr48hrChaperoneRPuritySampleActivity(Unit)Nochaperone,0hr200Nochaperone,48hr800W/chaperone,0hr4000Hydrolysisactivity特殊分子伴侣

目标蛋白需被宿主细胞切割活化后方可确保活性正确

切割活化后蛋白两个亚基通过分子间二硫键相连HEK293细胞表达纯化分泌蛋白

根据目标蛋白所在生物学通路，选取其上游激活蛋白与目标蛋白共转表达NochaperoneW/chaperoneSampleIntactproteinActivity(Unit)Nochaperone44%4500W/chaperone0%16000ProteinSplicingCaseStudies:RecombinantExpression义翘神州纯化策略缓冲液成分优化纯化工艺优化

表达和纯化双抗：scFv-KIHbsAbHEK293细胞表达

纯化分泌抗体

多步骤纯化策略以获得正确形式的抗体

全长单次跨膜蛋白(MW=~50KDa)

昆虫细胞表达

纯化胞内蛋白,Ni+SEC

优化缓冲液中去垢剂成分以促进蛋白的提取和稳定PBSwithDetergent1PBSwithDetergent2PBSwithDetergent3Step1:ProteinA-affinityPAGE>95%Monomer:43.9%MonomerAggregatesandmis-matchedchains(K-KandH-H)pIH-H>pIK-H>pIK-KStep2:IonexchangeH-HK-HK-KMonomerMonomer:41.8%Step3:GelfiltrationMonomerPAGE>95%Monomer:98.5%CaseStudies:RecombinantExpression义翘神州整体策略优化CaseStudies:RecombinantExpression

重组表达转录因子蛋白

蛋白高度无序，稳定性差昆虫细胞表达纯化胞内蛋白

构建、培养和纯化过程综合优化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合标签观察到目标蛋白表达

目标蛋白未GSH梯度洗脱

目标蛋白降解严重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培养体积=10XV1

蛋白降解

培养体积=V1

收集Elute2并置换Buffer

目标蛋白在高盐buffer中较为稳定Buffer[NaC