细胞毒性试验培训班用讲义课件学习教案

会计学1细胞毒性试验培训班用讲义细胞毒性试验的目的和意义（一）目的：评价医疗器械和材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、溶解、死亡或其它毒性反应。（二）意义：可在短期内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为体内法（动物试验）的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械和生物材料的研制和应用提供了重要保证。第1页/共23页国外标准简介1979年，美国国家标准局和牙科协会（ANSI/ADA41-1979）首先发布“口腔材料生物学评价标准”，其中规定用51Cr标记法检测供试品的细胞毒性。1984年，国际标准化组织（ISO）颁布的ISO/TR7405:1984《牙科材料生物学评价》中推荐了琼脂覆盖、分子滤过和51Cr标记三种试验方法。1989年，ISO专门成立TC194技术委员会，制定了ISO10993《医疗器械生物学评价》系列标准。在ISO10993-5：1992中，提出了三类细胞毒性试验方法，即浸提液试验、直接接触试验和间接接触试验。第2页/共23页国内标准简介1987年，卫生部标准WS5-1-1987《医用热硫化甲基乙烯基硅橡胶》：琼脂覆盖法1996年，GB/T16175-1996《医用有机硅材料生物学评价试验方法》：细胞增殖度法1997年，卫生部第81号文《生物材料和医疗器械生物学评价技术要求》：推荐了琼脂覆盖、分子滤过、细胞生长抑制三种方法。1997年，GB/T16886.5-1997等同采用国际标准ISO10993-5：1992第3页/共23页有几类细胞毒性试验方法？

GB/T16886.5－2003/ISO10993-5:1999中推荐了三类细胞毒性试验：

1）浸提液试验

2）直接接触试验

3）间接接触试验（包括琼脂扩散试验、滤膜扩散试验）

第4页/共23页常用的细胞毒性试验方法

1）浸提液试验（四唑盐（MTT）比色法或MTT法）：哺乳动物胞的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质，用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液，用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞的存活比例。该试验用于细胞毒性细定量评价。对该试验有干扰的供试品不适于本试验。

2）间接接触试验：琼脂扩散法或琼脂覆盖法第5页/共23页哪些产品需要进行细胞毒性试验？与人体接触或植入体内的医疗器械都需要进行细胞毒性试验。接触部位：

1）表面：皮肤、粘膜、损伤表面

2）外部接入：血路间接、组织/骨/牙、循环血液

3）体内植入：组织/骨、血液第6页/共23页试验材料：细胞系

推荐使用ATCCCCL1(NCTCclone929)[小鼠成纤维细胞]或ATCCCCL2(Hela)[人上皮细胞]。如能证明试验的重现性和精确性，也可选用其他细胞系。优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取。试验应使用无支原体污染细胞。用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。使用冻存细胞时,如加有细胞保护剂应除去,使用前至少传代培养一次。第7页/共23页细胞复苏步骤1）准备一杯40度的温水。

2）将细胞从液氮罐中取出迅速放入温水中，晃动使之溶解，注意过程控制在半分钟内。

3）离心，弃上清，加入新鲜培养基，接种至新培养瓶中。第8页/共23页试验材料：仪器

超净工作台、CO2培养箱、冰箱、倒置光学显微镜、光学显微镜、蒸汽灭菌器、液氮瓶、抽滤瓶、电热恒温水浴锅、96孔培养板、可调式微量加样器、酶标仪纯水机、液氮罐、天平、离心机等。第9页/共23页试验材料：耗材

培养瓶、培养板、吸管、冻存管、离心管、滤器等。

与供试品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121℃灭菌20分钟。第10页/共23页试验材料：试剂

培养基（MEM、DMEM、IMEM、RPMI1640等）、血清（小牛血清、新生牛血清、胎牛血清、马血清等）、消化液、L-谷氨酰胺、抗生素液、NaHCO3溶液、二甲基亚砜、平衡盐溶液。含血清或不含血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。注:培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。

第11页/共23页试验材料：供试液与对照供试液：应按产品标准规定制备样品浸提液。阴性对照：选用经确认过的不产生细胞毒性反应的材料，例如高密度聚乙烯。阳性对照：选用经确认过的可重现细胞毒性反应的材料，例如含有有机锡添加剂的聚氯乙烯。第12页/共23页试验步骤:MTT法a)培养细胞直至达到其对数生长期末细胞趋于融合，用细胞消化液消化分散细胞，用细胞培养液配制成1×104个/mL的细胞悬液。取96孔培养板，每孔中加入100μL的细胞悬浮液。轻轻水平转动培养板使细胞均匀地分散在皿孔的表面。b)置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱内,在37℃±2℃温度下培养24小时。第13页/共23页试验步骤:MTT法c)弃去原培养液，每孔加入100μL的空白对照液，阴性对照液，阳性对照液，100％和50％浓度的试验样品浸提液。每组至少设8孔。注：浸提原液或以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。采用0.9%氯化钠注射液浸提时,建议在稀释浸提液时使用浓缩的(如2倍或5倍)培养基。d)置含5％二氧化碳的二氧化碳培养箱,在7℃±2℃温度下进行培养。培养间期可分为24h、48h、72h。第14页/共23页试验步骤:MTT法e)每个培养间期后,每孔加入MTT溶液20μl，置含5％二氧化碳的二氧化碳培养,在37℃±2℃温度下培养5小时。f)弃去孔内液体，每孔分别加入200μlDMSO，将培养板放置10分钟，水平振摇使孔内溶液颜色均匀。g)用酶标仪测定吸光度，可采用双波长测定，选用的波长可为570nm和630nm。第15页/共23页试验步骤:MTT法h)结果计算：i)结果判断：根据RGR值，判定试验样品的细胞毒性。阴性对照组反应不大于1级。阳性对照组反应至少为3级。阴性对照组和阳性对照组反应不符合规定时应重新试验。

第16页/共23页试验周期及费用1）以MMT法为例：一般需要1－2周。注意：用选定的细胞系和培养基制备试验所需的细胞。使用冻存细胞时,如加有细胞保护剂应除去,使用前至少传代培养一次。2）根据国家发展和改革委员会、财政部文件（发改价格[2003]213号），细胞毒性试验的收费标准为2000元/项。第17页/共23页YZB标准中常见的问题不写明采用什么方法进行试验。只写无细胞毒性，无级别要求。无供试液的浸提条件。第18页/共23页试验原则

体外细胞试验方法较多，且各有其特点，各试验方法之间很难达到完全一致。因此在选择试验方法时，须根据“最接近应用状况”的原则，尽可能合理地选择供试品与细胞的接触方式和检测生物学终点评价方法。第19页/共23页有关法规

1，法规：医疗器械监督管理条例（国务院令第276号）

2，规章：医疗器械生产监督管理办法（局令第12号）

医疗器械生产企业质量体系考核办法（局令第22号）

医疗器械分类规则（局令第15号）

3，规范性文件：关于发布医疗器械注册产品标准编写规范的通知第20页/共23页有关标准1，行业标准

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0127.9口腔材料生物试验方法：细胞毒性试验（琼脂覆盖及分子滤过法）

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0268用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价第1单元：评价与试验项目选择

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0325一次性使用无菌导尿管第21页/共23页有关标准2，推荐性标准

GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评