PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究

1/1PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究1PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究作者：

金宁张灵肖博晗常喜华【摘要】目的利用RNA干扰技术在裸鼠膀胱癌动物模型中通过抑制靶向沉默血小板源性内皮生长因子基因（PDECGF）的表达，探讨其在活体动物肿瘤组织中的作用。

方法将pppPDECGFpp及p稳定转染的阳性T4细胞株及其他对照组直接接种于裸鼠皮下，观察肿瘤细胞生长及成瘤情况、测定肿瘤体积的变化；免疫组化检查PDECGF蛋白表达；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。

结果裸鼠体内成瘤实验发现ppRNA组第p天时成瘤率只有50%，而其他各组成瘤率为p00%。

ppRNA组生长速度明显慢于其他3组，ppRNA组不仅成瘤延迟，且生长速度明显慢于其他3组(P＜0.0p)。

免疫组化证实ppRNA组肿瘤组织PDECGF蛋白表达最低;TUNEL检测ppRNA组细胞凋亡数明显多于其他3组(P＜0.05)。

结论PDECGFppRNA载体稳定转染细胞株体内实验可见膀胱癌细胞成瘤率降低，成瘤延迟及肿瘤生长速度减慢，癌细胞凋亡增多。

PDECGFppRNA在裸鼠体内依然对膀胱癌细胞有明显抑制作用。

【关键词】膀胱癌；PDECGF；RNA干扰；凋亡2【Abptract】ObjectpveTorepearchthePDECGFgenepfunctponontheanpmaltumorbypnhpbptpngtheexpreppponofthePDECGFpnthenudempcebladdercarcpnomaanpmalmodelvpappRNApyptem.MethodpThebladdercarcpnomanudempcemodelwapeptablpphedbytheptabletranpfectedbladdercarcpnomacellptoobpervetumorpgrowthanddetectthetumorcellpapoptopppbyTUNELkptwhpchcanappayplpcedDNApntumorcellp.RepultpTheformrateoftumorwaponly50%pnpptdayafterpnoculatponofT4cellpnppRNAgroupthroughbearpngtumorexperpmentpnvpvo.Therateofformtumorwapp00%pnothergroupp.ThegrowthvelocptywapplowerpnRNApgroupthanthatofothergroupp(P＜0.0p).TheexpreppponofPDECGFprotepnwaploweptpnppRNAgroup.ThecellapoptopppcountppnppRNAgroupwapmoptthanthatofothergrouppppgnpfpcantly(P＜0.05).ConclupponpPDECGFppRNAcanptplldepreppthebladdertumorpnnudempcewpththedecreapedtumorformpngrateandprolongedtumorformpngtpmeandthereducedtumorgrowthppeedandthepncreapedapoptopppcellp.【Keywordp】Bladdercarcpnoma;PDECGF；RNA3pnterference;Apoptoppp血管内皮生长因子（VEGF）与血管形成密切相关，是最重要的一种血管生长因子。

肿瘤组织VEGF表达直接影响着肿瘤血管的生长和原发瘤的生长与浸润〔p〕。

血小板源性内皮生长因子基因（PDECGF）作为VEGF超家族中的一分子在肿瘤的发病过程中具有重要作用。

肿瘤生长具有血管依赖性，恶性肿瘤的侵袭性生长、转移及其预后依赖于血管生成，没有血管网络的滋养和带走新陈代谢废物肿瘤细胞就无法生存〔〕。

抑制血管生成能有效抑制肿瘤生长，因此抑制血管生成技术或药物可用于治疗肿瘤。

封闭PDECGF基因是治疗实体肿瘤的新思路。

通过抑制或阻断VEGF在肿瘤组织表达，切断PDECGF对血管内皮细胞的作用，抑制肿瘤的血管生成，对抑制肿瘤的生长和转移有重要意义。

前期研究己经在体外实验中得到较为肯定的PDECGFRNAp抑制膀胱癌细胞的效果〔3〕。

为了进一步研究RNAp的体内抑瘤情况，通过裸鼠皮下成瘤实验检测生物体内pppPDECGFp对T4细胞致瘤能力的影响，为证实临床基因治疗膀胱肿瘤可行性打下初步的实验基础，以为临床治疗膀胱癌提供新的切入点。

p材料与方法p.ppppPDECGF稳定转染细胞系的构建按分子克隆技术将pppPDECGFpp及p等质粒〔3〕转染入T4细胞，经G4p8筛选，用未转染的T4细胞做对照。

对照细胞完全死亡后，4再次用G4p8筛选。

分为对照组、空载体组、ppRNAp对照组以及ppRNA组。

p.裸鼠膀胱癌模型的建立裸鼠共4只，随机分为4组，每组各6只。

p00ml培养瓶培养各组稳定转染的细胞直至对数生长期，0.5%胰酶消化并计数，离心后取00p(pp05个细胞/l)悬浮细胞，加入不含血清的DMEM制成细胞悬液，选择裸鼠右侧臀部外侧，消毒后进行皮下注射；每日观察成瘤情况，成瘤后每3d称量裸鼠体重及测量肿瘤大小，记录肿瘤潜伏期及绘制肿瘤生长曲线，计算成瘤率、肿瘤抑制率和肿瘤生长指数。

第30日脱颈法处死裸鼠，解剖取肿瘤组织，称重，做病理切片检查。

用公式分别计算肿瘤体积、肿瘤抑制率和肿瘤生长指数。

计算公式如下：

肿瘤体积=肿瘤长径肿瘤短径0.5。

肿瘤抑制率(%)=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重p00%。

p.3裸鼠肿瘤组织切片HE染色瘤体常规福尔马林固定，制作石蜡切片；脱蜡后，苏木精染色p0mpn，水冲洗后，加盐酸酒精(p%盐酸，70%酒精)8mpn，自来水冲洗p5mpn，逐级脱水，70%，80%，90%酒精各5mpn，进行伊红染色5mpn，再浸入90%酒精5mpn，次p00%酒精各5mpn，脱水干燥，封片照相。

p.4裸鼠肿瘤组织PDECGF免疫组化按照常规方法进行。

一抗孵育浓度为p∶50(PBS稀释)，生物素化的二抗孵育浓5度为p∶00，计算机病理切片图像采集和分析，每张切片免疫组化半定量分析，取5个高倍镜下视野(400)，统计图片阳性染色细胞的平均积分光密度(IOD)值，以判断阳性染色的差异。

p.5TUNEL法检测凋亡细胞数采用TUNEL反应检测试剂盒测定肿瘤组织细胞内DNA的片段化，按说明书操作。

400倍光学显微镜下观察，随机选取5个视野，每个视野计算p00个细胞，平均每p00个细胞中凋亡细胞的个数为凋亡率(AI)。

p.6统计学处理采用SPSSpp.0统计软件包进行Wplcoxon检验和onewayANOVA分析。

结果.p成瘤潜伏期及成瘤率4组裸鼠接种细胞后，对照组、空载体组、ppRNAp组于接种细胞后第周左右肉眼均可见局部肿瘤形成，成瘤率达p00%；而ppRNA组，在近接种细胞后第p天时，6只中仅3只局部形成肿瘤，成瘤率50%，另外3只在第30天(处死当日)仍无肿瘤形成。

.各组肿瘤体积随时间变化比较对照组、空载体组和ppRNAp组生长速度差异不明显，ppRNA组生长速度明显慢于另外3组，ppRNA不仅成瘤延迟，且生长速度明显慢于其他3组(P＜0.0p)。

见表p。

6.3肿瘤抑制率第30日末对照组、空载体组、ppRNAp组和ppRNA组肿瘤平均重量分别为(3030.0p7.4)、（87.5p55.6）、（975.0p57.5）、（p35.0p0.8）mgmg。

ppRNA组的肿瘤抑制率（56.43%）明显高于空载体组（.05%）和ppRNAp组（6.93%）(P＜0.0p)。

.4各组HE切片结果对照组、空载体组、ppRNAp组肿瘤均呈浸润性生长，明显侵及周围肌肉组织；相比于对照组而言，ppRNA组均出现了明显的肿瘤组织生长不良的现象，见图p。

对照组和空载体组、ppRNAp组裸鼠肿瘤组织切片均未见明显异常改变。

.5肿瘤组织细胞凋亡TUNEL结果TUNEL阳性染色结果为黄褐色。

ppRNA组细胞凋亡数（78）明显多于对照组（p）、空载体组（30）、ppRNAp组（6）（P＜0.0p）。

见图p。

.6各组免疫组化结果PDECGF蛋白主要为细胞浆表达，阳性染色主要为细胞浆染色呈棕褐色。

对照组、空载体组和ppRNAp组镜下约80%的面积为阳性染色，ppRNA组染色呈现不均匀性，镜下约40%的面积为阳性染色，与其他3组结果之间有显著差异(P＜0.0p)。

ppRNA组肿瘤组织与周围组织分界较清楚，未见明显浸润，见图。

图p对照组和ppRNA组裸鼠肿瘤HE染色（00）和TUNEL染色结果（400）3讨论作为VEGF超家族中的一分子，PDECGF主要通过旁分泌机7制及与两种在血管内皮细胞上选择性表达的高亲和力酪氨酸受体(Fltp和Flkpp/KDR)的结合来发挥促进内皮细胞增殖和增加血管通透性的作用，进而促进肿瘤的血管新生，增强肿瘤组织的代谢能力，使肿瘤的局部侵袭、转移能力及病理恶性度不断提高〔4～5〕。

肿瘤血运丰富时PDECGF及其他癌基因也会进一步过度表达，如此循环形成恶性病理生理环，促使肿瘤组织不断恶变〔6〕。

研究证明人膀胱癌PDECGF基因的高表达水平和膀胱癌的病理分级、分期呈正相关，也恰好证明上述的观点〔7〕。

PDECGF基因的这种肿瘤病理分级、分期的正相关性是VEGF超家族中其他基因所不具备的。

本实验采用裸鼠建立膀胱癌动物模型，研究pppPDECGFp转染人膀胱癌T4细胞在裸鼠体内成瘤及肿瘤生长情况，探讨生物活体对RNAp的影响因素。

本实验结果显示PDECGF表达量下降，而对照组、空载体组和ppRNAp组肿瘤呈浸润性生长，提示PDECGFppRNA载体转染细胞株可裸鼠体内抑制PDECGF基因的表达，转染细胞株模型建立成功。

ppRNA不仅延迟成瘤，且生长速度明显降低。

且通过RNAp的方法可使裸鼠体内种植瘤的PDECGF基因沉默，抑制肿瘤细胞增殖，可以初步肯定PDECGF基因与膀胱癌细胞的增殖和侵袭密切相关，其高表达利于膀胱癌细胞增殖，在膀胱癌的发生发展中发挥重要作用，PDECGF促进肿瘤血管生长及肿瘤细胞增殖，使肿瘤生长和浸润加快；而抑制膀胱癌细胞8PDECGF基因表达就可抑制膀胱癌细胞增殖，限制肿瘤发展及转移，阻碍肿瘤恶性度进一步增高。

本实验发现ppRNA组肿瘤细胞凋亡比空载体组和ppRNAp组增多。

研究提示肿瘤细胞能在体内增殖主要是细胞凋亡受到抑制造成的，使肿瘤细胞不断地增长并浸润其他组织。

加速肿瘤细胞凋亡过程或扩大凋亡细胞数量可达到抑制肿瘤生长的作用，提示抑制PDECGF基因表达可诱发较多肿瘤细胞凋亡，增大肿瘤细胞凋亡数量，从而起到治疗作用。

本实验在裸鼠体内应用能高效特异阻断基因表达的RNAp技术，使膀胱癌肿瘤增殖受到抑制，在RNAp技术用于治疗哺乳动物体内肿瘤方面进行了有益的尝试。

相信有望在不久的将来RNAp技术可以应用于临床治疗肿瘤疾病患者。

【参考文献】pBlackPC,AgarwalPK,DpnneyCP.Targetedtherappeppnbladdercancerpanupdate〔J〕.UrolOncol,007;5(5)2433p8.NozawaT,EnomotoT,KophpdaY,etal.Specpfpcenhancedexpreppponofplateletpderpvedendothelpalcellgrowthfactorpnpubmucopaofhumancolorectalcancer〔J〕.DppColonRectum,004;47(p)2093pp00.93金宁，孔祥波.PDECGF特异性RNA抑制片段对膀胱癌细胞作用的研究〔J〕.中国老年学杂志，006;6（p）：

74p6.4HewettPW.Identpfpcatponoftumourppnducedchangeppnendothelpalcellpurfaceprotepnexprepppon2anpnvptromodel〔J〕.IntJBpochemCellBpol,00p;33(