IL-6和MMP-9在大鼠重症急性胰腺炎过程中的作用

1/1IL-6和MMP-9在大鼠重症急性胰腺炎过程中的作用IL-6和MMP-9在大鼠重症急性胰腺炎过程中的作用赵蕊，陈少夫赵蕊，沈阳市第六人民医院辽宁省沈阳市110006赵蕊，中国医科大学硕士研究生毕业，现任沈阳市第六人民医院主治医师，主要从事消化内科疾病的研究.通讯作者:陈少夫，110004，沈阳市和平区文化路26号，中国医科大学盛京医院消化内科.Theeffectsofinterleukin-6andmatrixmetalloproteinases-9onsevereacutepancreatitisinratsRuiZhao，Shao-FuChenRuiZhao，TheSixthPeoplesHospitalofShenyangCorrespondenceto：

Shao-FuChen，District，Shenyang，110004,ShengJingHospitalofChinaMedicalUniversity26WenhuaRoad，HepingAbstractAIM：

Inthispaper,toinvestigatetheroleofinterleukin6(IL-6)andmatrixmetalloproteinases-9(MMP-9)aswellastherelationshipofIL-6andMMP-9duringthedevelopmentofsevereacutepancreatitis,wedeterminedtheexpressionofIL-6andMMP-9ofpancreastissueinaratmodelofsevereacutepancreatitis.METHODS：

SixtyadultWistarrats(170-190g)wererandomlydividedintosixgroups.Severeacutepancreatitismodelonratswasestablishedbyretrogradeinjectionof4.5%sodiumtaurocholate(1mL/kgbody)intobiliopancreaticductthroughduodenalwall.Ratsweresacrificedat1，2，3，4and5daysafterinductionofpancreatitis.TheexpressionofIL-6andMMP-9inpancreastissuewasdeterminedbyimmunohistochemistry.RESULTS：

Incontrolpancreastissue,immunohistochemistrystainshowedthatIL-6andMMP-9expressionswereabsentandweak,respectively.TheexpressionsofIL-6andMMP-9significantlyincreasedintreatmentgroups,andwerehigherthanthoseincontrolgroup(P0.05).TheexpressionsofIL-6andMMP-9reachedtheirpeaksat3daysand4days,respectively.CorrelationanalysisrevealedthatIL-6waspositivelycorrelatedwithMMP-9(rs=0.317,P=0.025).CONCLUSION：

TheexpressionsofIL-6andMMP-9significantlyincreasedintheSAPrats,whichmightplayakeyroleinthedevelopmentofSAP.TheexpressionofIL-6showedpositivecorrelationwiththatofMMP-9.ItrevealedthatthereleaseofIL-6duringSAPmightimprovethereleaseofMMP-9directlyorindirectly.Keywords：

Interleukin-6；MatrixMetalloproteinase-9；Severeacutepancreatitis摘要目的：

介素-6（IL-6）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织中的变化，研究IL-6及MMP-9在重症急性胰腺炎（SAP）发病机制中的地位及两者的相关性，从而为SAP的发病提供更为可靠的理论依据。

方法：

选取雄性Wistar大鼠60只，体重170-190g，随机分组，每组10只。

以1ml/Kg注射4.5%牛磺胆酸钠后1天、2天、3天、4天、5天分别断头处死大鼠，取胰腺组织制成蜡块。

经免疫组织化学检测IL-6及MMP-9，并用多媒体彩色图像分析仪对上述二指标进行图像定量分析。

结果：

IL-6免疫组化染色在对照组无表达，其它各个时期高表达，各实验组与对照组比较P0.05，差异有显著性。

各实验组间，第3天达最高峰，第3天与其它组比较P0.05，差异有显著性。

MMP-9免疫组化染色在对照组为低表达，其它各个时期高表达，各实验组与对照组比较PP0.05，差异有显著性。

各实验组间，第4天达最高峰，第4天与其它组比较P0.05，差异有显著性。

IL-6与MMP-9的相关系数rs=0.317,P=0.025(相关的显著性水平为0.01)，证明两者有正相关性。

结论：

IL-6与MMP-9在大鼠重症急性胰腺炎时均显著升高，二者可能与其发病及病情的严重性呈正相关。

IL-6与MMP-9在大鼠重症急性胰腺炎时二者升高有正相关性，可能IL-6直接或间接促进了MMP-9的释放。

关键词：

白细胞介素-6；基质金属蛋白酶-9；重症急性胰腺炎本文以重症急性胰腺炎动物实验模型为研究对象，通过定量分析白细胞0引言急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）是胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化的化学性炎症。

按临床表现，可分为轻型急性胰腺炎（MAP）和重症急性胰腺炎（SAP）两种。

急性胰腺炎是一种潜在的致死性疾病，临床上大多为自限性轻型急性胰腺炎，但仍有10%-20%患者进展为重症急性胰腺炎(SAP)，并发全身炎症反应综合症(SIRS)和多器官功能衰竭(MSOF)，病死率在10%以上[1]。

SAP病情发展迅猛，病死率高，其发病机理尚未完全阐明[2]。

目前比较公认的三大机制是胰腺胰酶自身消化、胰腺血循环障碍和白细胞过度激活三者相互影响，其中白细胞过度激活被认为是引起胰腺病情加重，多器官功能衰竭以至死亡的重要原因[3]。

从1988年提出的白细胞过度激活学说至最近阐述的第二次打击理论，即炎性因子的产生及其级联瀑布效应，使得胰腺局限性炎症反应发展为威胁生命的重症急性胰腺炎[4]。

重症急性胰腺炎发病急骤，病情凶险，治疗困难，死亡率高，是当前所关注的热点。

近年来，有关细胞因子及基质金属蛋白酶类在重症急性胰腺炎发病中的作用已受到重视。

随着研究的进展，目前认为单核巨噬细胞系统异常激活并产生过多的细胞因子是SAP时局部和全身并发症的主要机理。

本文以重症急性胰腺炎动物实验模型为研究对象，通过白细胞介素-6（IL-6）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在重症急性胰腺炎过程中的作用，观察胰腺组织的病理改变，研究IL-6及MMP-9在SAP发病机制中的地位及两者的相关性。

从而为SAP的发病提供更为可靠的理论依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1选取健康雄性Wistar大鼠60只，体重170-190g，由中国医科大学实验动物中心提供。

随机分组，每组10只。

分为对照组(即制模前),制模后1d、2d、3d、4d、5d组。

1.1.2试剂和器材：

IL-6免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司，一抗为兔IgG多抗，二抗为山羊IgG多抗；MMP-9免疫组化试剂盒购于北京中山公司，一抗为兔IgG多抗，二抗为山羊IgG多抗。

实验仪器：

MetaMorph/DP10/BX41彩色病理图像分析仪（UIC/OLYMPUS.US/JP）。

OLYMPUSC3040-ADU.3J10641彩色图像摄录输入仪（JAPAN）。

1.2方法1.2.1重症急性胰腺炎实验动物模型的制作：

大鼠，术前12h禁食，不禁水，10%戊巴比妥钠30mg/kg经腹腔注射麻醉后，碘伏消毒后备皮，沿腹白线正中切口入腹，用消毒棉签寻找十二指肠和胰腺，用动脉夹在肝门处阻断胆管，经十二指肠找到胆胰管开口，用钝注射针头穿刺，并按1ml/kg注射4.5%牛磺胆酸钠，注射时间超过30s，针头和动脉夹保留2min后撤掉，关腹，送回动物饲养室，观察大鼠活动变化。

动物饲养环境无菌，温度适宜，昼夜相间，备好充足的饮用水和饲料。

重症急性胰腺炎实验动物模型制成。

1.2.2实验步骤：

按上述方法进行操作。

对照组大鼠注射等量的0.9%氯化钠液。

实验组大鼠注射4.5%牛磺胆酸钠后1d、2d、3d、4d、5d分别断头处死大鼠。

剥离周围的淋巴组织和脂肪组织，切取胰腺。

手术按照操作规程进行，标本用10%中性福尔马林溶液固定。

进行石蜡包埋切片。

HE染色，常规光镜下见间质肿胀，大量炎细胞浸润，红细胞渗出，腺泡细胞和脂肪坏死。

1.2.3IL-6和MMP-9免疫组织化学染色：

利用石蜡切片按常规SP方法进行：

将胰腺组织制成厚4m的连续切片，进行免疫组化染色，具体步骤如下：

常规脱蜡至水，3%过氧化氢37℃孵育10min，高温高压修复20min，自然冷却后水洗，0.01MPBS三次5min，10%正常血清。

分别用一抗IL-6抗体（IgG，1：

100）和MMP-9抗体（IgG，1：

75），37℃过夜。

0.01MPBS三次5min。

二抗（生物素标记）37℃30min。

0.01MPBS三次5min。

SP37℃30min。

0.01MPBS三次5min。

DAB显色5min，水洗，苏木素衬染5min，水洗30min。

梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.4图像分析定量方法：

于40倍物镜下用OLYMPUSC3040-ADU彩色图像摄录输入仪将图像输入MetaMorph/DP10/BX41彩色图像分析仪，每张切片选取四周及中央5个区域，均取该区域阳性反应最多的视野，测阳性反应面积比（阳性面积/胰腺组织面积*100%），即平均光密度值，再取平均值。

1.2.5统计学方法：

用SPSS11.0统计软件对数据进行统计分析,计量资料用XS表示,差异显著性采用单因素方差分析。

IL-6和MMP9相关分析采用Spearmans相关分析。

2结果2.1胰腺组织HE染色观察结果：

正常对照组，胰腺结构完全正常，无出血和坏死。

实验组胰腺组织间质肿胀，红细胞渗出，弥漫性出血及片状坏死，腺泡细胞和脂肪坏死，且可见腺小叶大量炎症细胞浸润，其中可见中性粒细胞、淋巴细胞等。

2.2IL-6和MMP-9免疫组织化学染色结果。

IL-6和MMP-9染色阳性判断：

细胞浆出现棕黄染色或伴有细胞核棕黄色颗粒为阳性。

从表1中可以看出，IL-6免疫组化染色在对照组无表达，其它各个时期持续的高表达，主要表达于胰腺腺泡胞浆内及细胞外基质。

各实验组（*）与对照组比较P0.05，差异有显著性；各实验组间，第3d达最高峰，第3d与其它组比较P0.05，差异有显著性。

MMP-9免疫组化染色在对照组为低表达，其它各个时期高表达，主要表达于胰腺腺泡胞浆内及细胞外基质。

各实验组（*）与对照组比较P0.05，差异有显著性；各实验组间，第4d达最高峰，第4d与其它组比较P0.05，差异有显著性。

表1，IL-6和MMP-9在各个时期的检测结果（均值标准差）IL-6000.3430.031﹡0.3770.031﹡0.4210.016﹡0.3880.013﹡0.3790.001﹡MMP-90.1100.0200.3320.015﹡0.3350.009﹡0.3620.028﹡0.4450.020﹡0.3450.021﹡正常对照注射后1d注射后2d注射后3d注射后4d注射后5d2.3IL-6与MMP-9的相关性：

IL-6与MMP-9的相关系数rs=0.317,P=0.025(相关的显著性水平为0.01)，证明两者有正相关性。

随着IL-6于第3d高峰值的出现，MMP-9也于第4d形成高峰值。

0.500.450.400.350.30IL_60.500.450.400.350.30MMP_9图1，大鼠胰腺组织中IL-6与MMP-9的散点图图2，IL-6在大鼠正常胰腺组织中的免疫组化片（400）图3，IL-6在大鼠制模第3天时胰腺组织中的免疫组化片（400）图4，MMP-9在大鼠正常胰腺组织中的免疫组化片（400）图5，MMP-9在大鼠制模第4天时胰腺组织中的免疫组化片（400）4讨论重症急性胰腺炎病情迅猛，死亡率高，其发病机理尚未完全阐明。

近年来，有关细胞因子及金属蛋白酶类在重症急性胰腺炎（SAP）发病中的作用已受到重视。

本实验旨在研究IL-6与MMP-9在SAP发病过程中的作用及两者的相关性，为SAP的发病提供更为可靠的理论依据，帮助和指导临床。

目前认为单核巨噬细胞系统异常激活并产生过多的细胞因子是SAP时局部和全身并发症的主要机理。

有实验研究，炎症等疾病的发生和病程与IL-6的异常表达有着密切相关性[5]。

细胞因子IL-6是一种26KDa的糖蛋白，主要由单核细胞产生，也可由激活的巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等产生。

IL-6协调IL-1，促进B细胞分化和抗体产生，促进急性期发生，诱导和调节急性期蛋白的合成，能直接反映机体病变和损害的严重程度。

IL-6可作用于多种靶细胞，起到刺激炎症的作用，能激化炎性细胞对炎性介质的效应，并发多脏器功能衰竭（MSOF）用，并可致重症急性胰腺炎向多脏器功能衰竭发展。

有实验显示，IL-6是炎症反应中的重要促炎因子，在重症急性胰腺炎患者中IL-6水平明显增高[7]。

国内外的研究证实，IL-6与SAP关系极为密切。

从本实验结果可以看到，IL-6免疫组化染色在对照组无表达，其它各个时期持续的高表达。

第1、2天逐渐升高，第3天达最高峰，第4、5天有所下降，但仍比第1天明显升高。

这与Mckay等[6]报道，SAP患者发现有全身并发症者发病1周内外周血单核细胞中IL-6的分泌显著增高相一致；也与Chen等[8]报道发现SAP患者血清IL-6水平在第1～7天显著升高相一致。

说明IL-6在SAP发展中起重要作用。

另有实验证实，TNF-、IL-1b等致炎细胞因子能显著增高胰腺腺泡肌成纤维细胞IL-6mRNA的表达及IL-6的分泌[9]，以IL-6为主的大量炎性细胞因子可致重症急性胰腺炎向多器官功能衰竭发展[10]，IL-6甚至可以作为预示急性胰腺炎患者并发呼吸衰竭的指标[11]。

而IL-6作用机制可能是：

协调IL-1，促进B细胞分泌和抗体产生，促进肝细胞合成急性期反应蛋白催化[12]和放大炎性反应，造成组织细胞的损害；延迟中性粒细胞（PMN）凋亡，保持大量PMN的存活及其产生氧自由基的能力；与TNF-协同作用，作用于广泛的微血管系统，造成微循环血栓形成及组织损伤[13]；刺激血管内皮细胞收缩，间隙增宽，血管通透性增加，促进白细胞加速边集、附壁和游出血管壁[14]。

在SAP早期通过检测IL-6可预测SAP的严重程度[15]。

我们的实验发现，重症急性胰腺炎时IL-6在发病5天内胰腺组织中持续性显著升高，提示IL-6在重症急性胰腺炎发病的过程中起重要作用，并与病情严重性呈正相关。

基质金属蛋白酶9（MMP-9，Matrixmetalloproteinase-9）是金属蛋白酶家族中分子量最大的酶（以92KD酶原形式存在），又称明胶酶B。

MMP-9是一种糖蛋白，可由中性粒细胞、单核细胞、血管内皮细胞等多种细胞分泌。

活化的MMP-9具有基质金属蛋白酶的一些共同特点[16]：

①能裂解一种或多种细胞外基质；②可被金属蛋白酶组织抑制剂（TiMPs）及耦合剂所抑制。

正常情况下，MMP-9的活性被控制在较低水平，主要参与机体的生理活动的需要。

但在异常[6]。

有实验表明IL-6在急性胰腺炎发病及发展的过程中发挥重要作情况下，高度表达在炎症、组织重塑等各种病理生理过程中发挥重要作用。

本实验经免疫组化检测发现，MMP-9在对照组为低表达，其它各个时期高表达。

第1、2天平稳升高，第3天明显升高，第4天达最高峰，第5天降至第3天水平。

这与有些学者的研究相一致，认为MMP-9在SAP中与病情的严重程度有明显相关性[17]。

还与Gibb等通过急性胰腺炎模型观察MMP对器官衰竭和组织重塑作用的结果相一致，发现SAP时肺均浆和腹水中MMP9活性增加，从而认为MMP9的活性与SAP的严重性有关。

MMP-9是降解细胞外基质（ECM）的主要因子[18]，Lohr[19]等研究认为，SAP病程中伴有细胞间基质的分解，并与病情的严重性相关，从而间接证明MMP-9在SAP疾病的发生发展中起重要作用。

另外，Toblas等[20]研究也发现正常肺组织中无MMP-9，而在SAP中高水平的表达。

并且在进一步的研究中发现，应用胰蛋白酶、TNF-、IL-1和佛波脂（PMA）均可以诱导中性粒细胞释放MMP-9，这与SAP的发病机制一致。

因此认为，MMP-9在SAP中通过胰蛋白酶和前炎症因子刺激中性粒细胞释放，与SAP的严重性相关。

本实验发现，IL-6与MMP-9在重症急性胰腺炎发病过程中均明显升高，且MMP-9高峰值晚于IL-6。

通过统计学分析，二者有正相关性。

因为IL-6在重症急性胰腺炎发病过程中有放大炎性反应作用，造成组织细胞的损害，并延迟中性粒细胞（PMN）凋亡，保持大量PMN的存活，而PMN在前炎症因子的刺激下，大量释放MMP-9。

因此在重症急性胰腺炎发病过程中检测IL-6与MMP-9，有利于判断疾病的严重程度，是反映胰腺炎病情进展及严重程度的重要指标。

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