义翘讲堂《高质量重组病毒蛋白的开发及应用案例分析》

北京义翘神州科技股份有限公司高质量重组病毒蛋白开发及应用案例分析CONTENT义翘神州重组蛋白技术平台简介1重组病毒蛋白应用案例3重组病毒蛋白开发及案例分析2重组蛋白技术平台简介01义翘神州重组和天然提取蛋白比较来源限制动物源含量低批间差异大重组技术无动物源可放大批间差异可控天然蛋白重组蛋白义翘神州载体/宿主序列载体选择宿主选择培养基转染方式培养温度和时间上清/胞内裂解方式纯度基本流程蛋白分析宿主选择载体克隆小试表达方案优化放大生产质量检测（4）多种准确、快速的大分子质量验证平台如何获得重组蛋白⑴（2）（3）培养条件纯化方法义翘神州大肠杆菌杆状病毒-昆虫细胞哺乳动物细胞原核表达系统成本低廉表达迅速易于放大表达的蛋白不具备翻译后修饰蛋白可能以包涵体形式表达，提升纯化难度难以表达高分子量蛋白真核表达系统正确的翻译后修饰(糖基化、磷酸化…)易于放大高密度细胞培养，有助于大量表达表达蛋白多为可溶糖基化程度低成本相对较高适用于病毒蛋白表达(胞膜+衣壳)：冠状病毒S蛋白，N蛋白真核表达系统正确的翻译后修饰(磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化…)表达蛋白多为可溶多用于分泌蛋白的表达成本相对较高培养周期相对较长适用于病毒蛋白表达(胞膜蛋白中的糖蛋白)：冠状病毒S蛋白表达系统的选择义翘神州

转染培养基培养工艺

培养时间影响蛋白表达多个环节细胞生长适合转染不适合转染培养条件（HEK293）义翘神州转染质粒的质量转染试剂的选择：脂质体、阳离子等细胞状态质粒和细胞的比例剪切力：搅拌、鼓泡等溶氧pH培养温度和时间质粒在培养过程中的丢失和降解蛋白表达通常随时间增加跟踪表达量蛋白降解和聚集现象也随时间增加细胞裂解膨胀法去污剂破膜法高压匀浆破碎法超声破碎法固液分离高速离心深层过滤微滤超滤粗纯亲和纯化:镍柱离子交换疏水层析精纯亲和纯化离子交换疏水层析凝胶层析蛋白质所在的定位：分泌、胞内、膜上纯化义翘神州质量控制整合多种技术优势

多种准确、快速的大分子质量验证平台多平台大分子相互作用分析技术Octet\Biacore全面的理化测定技术SEC-HPLC\ELISA\BLI\SPR多种细胞活性和酶活性测定技术稳定性筛选技术下游应用验证平台准确、快速筛选出最优质的生物试剂高纯度具有生物学活性批间稳定ISO9001CertifiedCNAS13485Certified义翘神州6000+蛋白优化的四大表达体系：动物细胞/昆虫细胞酵母/细菌突破传统工艺限制11天研制工业级原料并供应集成创新的核心技术：高效表达载体高效转染试剂高效培养基、高密度细胞培养特异性的纯化工艺技术多平台质量控制和筛选技术2009年H1N1HA蛋白30天2013年H7N9HA蛋白12天2021年OmicronS蛋白6天43种病毒400多种病毒株抗原蛋白1000多种抗原覆盖广度和深度义翘神州集成创新的快速生物试剂制备及筛选技术平台应急响应速度：多次全球首发义翘神州重组病毒蛋白开发及案例分析02义翘神州EbolaInfluenzaHIVCoronavirusZIKAHCV胞膜蛋白核衣壳蛋白表面糖蛋白病毒基因组酶病毒分类依据：DNA病毒*RNA病毒*Prion(朊病毒)病毒各组件及其功能VirusTaxonomy:2020Release,9110species组件功能COV19实例(义翘蛋白产品货号)基因组各病毒蛋白表达的模板，指导病毒增殖RNA病毒，以单链RNA作为遗传物质酶催化基因组转录/逆转录，催化其他蛋白合成和后处理PLpr(40593-V07E)，3CLpro（40594-V56B）衣壳蛋白包被基因组，基因组释放，新病毒颗粒组装…衣壳蛋白(N蛋白，40588-V08B)含419个氨基酸，包裹~29900碱基长度的基因组包膜蛋白病毒形态，侵染宿主，介导内吞，病毒组装…由S蛋白，E蛋白，M蛋白共同组成糖蛋白识别宿主细胞表面靶点，介导病毒侵入…S蛋白(40589-V08B1)与上皮细胞表面ACE2结合，结合活性高于SARS的S蛋白TMVPhage义翘神州LowexpressionlevelPrecipitationAggregationDegradationPTMActivityvariations病毒重组蛋白表达中遇到的一些问题11666.245.035.025.018.414.411666.245.035.025.018.414.4义翘神州关键因素义翘神州表达宿主表达序列表达载体酶切位点、标签、启动子信号肽蛋白表达培养基转染方式培养温度培养时间蛋白纯化制剂筛选质量检测新冠病毒ssRNA(+)RefSeq:NC_045512.2SARS-COV2基因组：碱基数–29903ORF–10编码蛋白>25个种类名称+作用蛋白产品应用结构蛋白S/E/M/N，病毒颗粒组装，宿主结合，病毒入侵病毒机理研究诊断试剂开发中和抗体开发疫苗开发非结构蛋白Nsp1~Nsp16，酶类以及其辅助蛋白，病毒基因组扩增，蛋白剪切抗病毒药物开发ORForf3a;orf3b;orf6;orf7a;orf7orf8;orf9b;orf9c;orf10，辅助蛋白，功能不详N/A义翘神州40591-V08H（S1，HIS）诊断原料的开发1，控制培养条件控制剪切力、泡沫控制培养时间控制培养温度2，

SEC精纯去除聚集体表达系统：HEK293蛋白标签：His义翘神州40591-V08H（S，HIS）诊断原料的开发规模化生产的挑战-瞬转体积达到500L以上：不是简单的体积放大—瞬转规模化放大生产业内缺乏经验—需要重新优化培养、转染、纯化条件和关键参数—常见问题：蛋白聚集、降解、产量不稳定气泡培养放大剪切力蛋白酶表达量降低降解增加纯化时间蛋白吸附蛋白产量蛋白降解蛋白聚集释放反应器大容量色谱柱纯化放大义翘神州SARS-COV-2spike三聚体蛋白的开发Spike蛋白具有多处抗体表位阶段1：RBD中RBM和ACE2结合阶段2：Furin+TMPRSS2双酶切阶段3：fusionpeptide(FP)辅助膜融合，实现入侵诊断用抗原、中和抗体开发、疫苗开发、病毒生物学特性研究图片来自：Caietal.,Science369,1586–1592(2020)Spike蛋白应用义翘神州SARS-COV-2spike三聚体蛋白的开发HexaPro重组蛋白表达量提高、更稳定(Ching-LinHsieh,

etal.2020)HPLC2P6P（表达量×5倍）位点突变F817P,A892P,A899P,A942P,K986P,V987P+furincleavagesitemutantsMALS义翘神州

SARS-COV-2spike三聚体蛋白的开发：SEC-MALSValidatedB.1.1.529PrefusionTrimericSpikeSuperStabilityofOmicronS-ECDtrimerS-ECD-trimer（40589-V08H26）>90%bySDS，>95bySEC-HPLCEC50

is4-15ng/mL>95%bySEC-MALSmolecularweightisaround480-550kDa

Affinityconstantof1.52nMasdeterminedbyBLIHighpurityandSEC-MALSvalidationBioactivitybyELISAandBLI货号毒株40589-V08H4WT40589-V08H28Omicron(BA.2)40589-V08H29Omicron(BA.1.1)40589-V08H26Omicron(B.1.1.529)40589-V49H3-B(Biotinylated)Omicron(B.1.1.529)40589-V08H34(pre-order)Omicron(BA.2.12.1)40589-V08H33(pre-order)Omicron(BA.5)40589-V08H32(pre-order)Omicron(BA.4）/research/virus/sars-cov-2-prefusion-trimeric-spike-variant-protein义翘神州NP功能：结合病毒RNA，形成RNP，稳定病毒基因组新冠病毒N蛋白的开发N2b+SB/N3可四聚高聚蛋白Ye,

Q,.etal.bioRxiv

2020.05.17.100685;

doi:

/10.1101/2020.05.17.100685.Kang,S.,etal.,ActaPharmaceuticaSinicaB,/10.1016/j.apsb.2020.04.009InsectcellOligomer=34%InsectcellBufferoptimizedOligomer=50%E.coliOligomer=95%InteractionswithaNPSpecificAntibody稳定的低聚蛋白E.coliRHPLC>90%低聚体蛋白HPLC-40588-V07E（WT）40588-V07E34(Omicron)货号毒株40588-V07E35Omicron(BA.2)40588-V07E34Omicron(B.1.1.529)40588-V07E32Delta(AY.1,AY.3)40588-V07E29Delta(B.1.617.2)HPLC-40588-V07EWTHPLC>90%低聚体蛋白义翘神州新冠生命周期及靶点，图片源自参考文献：Zeenat,etal.蛋白名称功能义翘产品NSP3,papain-likeproteinase蛋白剪切，病毒增殖，宿主干扰素信号通路抑制40593-V07E，40638-V07ENSP5,3C-likeproteinase,mainprotease(Mpro)蛋白剪切，病毒增殖40594-V07B，40594-V56BNSP7NSP7+NSP8在单链RNA周围形成八聚体，转录起始和引物延申40617-VNCENSP8NSP7+NSP8在单链RNA周围形成八聚体，转录起始和引物延申40618-VNCE，40618-V17ENSP9,ssRNA-bindingprotein单链RNA结合蛋白，与NSP7/8/12一起形成聚合体*40619-V40ENSP10,growth-factor-likeprotein(GFL)锌指蛋白，在病毒RNA复制中起作用，距今NSP16的酶活性*40599-VNCE，40599-V07ERNA-dependentRNApolymerase(RdRp,NSP12)病毒RNA聚合酶，病毒基因组RNA复制增殖40595-V08BHelicase(NSP13)与NSP14一起介导病毒RNA在细胞质中添加5’cap40596-V07E2'-O-ribosemethyltransferase(NSP14/NSP16)病毒基因组复制，与NSP13一起介导病毒RNA在细胞质中添加5’cap40598-V07E种类名称+作用蛋白产品应用非结构蛋白Nsp1~Nsp16，酶类以及其辅助蛋白，病毒基因组扩增，蛋白剪切抗病毒药物开发新冠病毒非结构蛋白的开发义翘神州新冠3CLpro和PLpro的开发3CLpro蛋白结构图，图片源自参考文献：LinlinZhang,etal.PLpro蛋白结构图，图片源自参考文献：XiaopanGao,etal.义翘神州流感病毒蛋白功能应用HA（血凝素）宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合；凝血作用流感基础性研究，病毒检测试剂研究流感疫苗研发，抗体开发NA（神经氨酸酶）水解唾液酸受体，促进成熟病毒颗粒释放流感基础性研究，病毒检测试剂研究抗病毒药物研发，流感疫苗研发NP（核蛋白）与流感遗传物质结合，参与病毒基因复制、转录、翻译；维持病毒基因稳定性流感基础性研究，抗病毒药物研发，诊断产品开发，抗体开发分类：

流感病毒属于正黏液病毒科，负链RNA病毒。其中甲型流感（A）、乙型流感（B）、丙型流感（C）会感染人类。结构：流感病毒颗粒由包膜、基质蛋白和核三部分组成HA、NA、NP是三个非常重要的靶点蛋白义翘神州HA0被胞内Furin裂解成HA1+HA2。HA1与宿主细胞表面唾液酸结合诱导病毒导入，HA2形成三聚化。Lu,Y.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2014,111,125-130.流感HA蛋白开发HA（A/Anhui/1/2013,Cat:40103-V08B)HighpurityBioactivityMeasuredbyitsabilitytoagglutinateguineapigredbloodcells.HAtiteris0.5-2.5μg/mLfor1%GRBCHA（B/Phuket/3073/2013，Cat：40498-V08B）Purity：>95%asdeterminedbySDSBindingactivitytosialicacidBLI:18.4nM（40116-V08B）AgglutinationActivity义翘神州流感NA蛋白开发/10.3389/fmicb.2019.00039InfluenzaAH1N1(A/California/04/2009)Neuraminidase/NA(HisTag)货号种属毒株活性11058-V08BH1N1A/California/04/2009Active40568-V08BH1N1A/Michigan/45/2015Active40569-V08BH3N2A/HongKong/4801/201Active11676-V08BH5N1A/Anhui/1/2005Active40647-V08BH1N1A/swine/Henan/SN13/2018Active40652-V08BH1N1A/swine/Henan/SN13/2018)Active7108pmoles/min/μg毒株货号活性A/Darwin/9/2021(H3N2)40860-V08BActiveA/Darwin/6/2021(H3N2)40869-V08BActiveB/Austria/1359417/202140863-V08BActiveA/Victoria/2570/2019(H1N1)

40785-V08BActiveA/Wisconsin/588/2019(H1N1)40785-V08BActiveB/Phuket/3073/201340502-V07BActive无活性RecombinantNAfor2022-2023InfluenzaVaccineStrainsOtheractiveNAproducts义翘神州呼吸道合胞病毒RSV是一种包膜病毒RSV病毒颗粒直径100-300nm基因组长约15.2kb包含10个基因，编码11种蛋白质主要结构蛋白蛋白质名称功能应用融合蛋白F介导宿主受体融合、介导合胞体的形成、HLA和T细胞识别的靶点、保守性强疫苗、药物开发、诊断表面黏附糖蛋白G介导病毒与细胞接触、高度变异疫苗核衣壳蛋白N包裹病毒基因组诊断、疫苗

义翘神州HighPurityRSVA（strainLong）

Cat：40831-V08B货号抗原标签毒株40830-V08HRSV-GC-HisstrainA240829-V08HRSV-GC-Hisstrain1853740041-V08HRSV-GC-HisRSVA,strainLong40626-V08HRSV-GC-HisRSVA/Homosapiens/USA/LA2_94/201311070-V08B2RSV-GC-HisRSVA,strainrsb173411070-V08H2RSV-GC-HisRSVA,strainrsb173413029-V08HRSV-GC-HisRSVA,strainB111070-V08HRSV-GC-HisRSVA,strainrsb173440831-V08BRSV-FC-Hisstrainlong40832-V08BRSV-FC-Hisstrain1853740627-V08BRSV-FC-HisRSVA/Homosapiens/USA/LA2_17/201340628-V08BRSV-FC-HisRSVB40037-V08BRSV-FC-HisRSVA,strainRSS-211049-V08BRSV-FC-HisRSVA,strainA2应用

WB推荐稀释比1:1000-1:5000（对于重组蛋白的检测）泳道1：RSV-F（A2）蛋白（Cat：11049-V08B）泳道2：RSV-F（StrainRSS-2）蛋白（Cat：40037-V08B）泳道3：RSV-F（RSVB）蛋白（Cat：40628-V08B）泳道4：RSV-F（RSVA/Homosapiens/USA/LA2_17/2013）蛋白（Cat：40627-V08B）泳道5：RSV-F（A,StrainLong）蛋白（Cat：40831-V08B）泳道6：RSV-F（B,Strain18537）蛋白（Cat：40832-V08B）RSVA（strainA2）

Cat：11049-V08B验证RSV-FELISA试剂盒（Cat：KIT11049，Cat：SEK11049）RSV主要蛋白的开发验证抗RSV-F（A2）兔单抗（Cat：11049-R302）的应用：义翘神州重组病毒蛋白应用案例03义翘神州北京协和医学院秦川团队，构建了人ACE2转基因小鼠模型，利用S1蛋白检测攻毒后小鼠的血清抗体水平。*Linlin,Bao.,etal.,ThePathogenicityofSARS-CoV-2inhACE2TransgenicMice.

Nature.支持结构分析研究检测康复病人血样抗体水平病毒学研究中的应用*Yin,W.,etal.,StructuresoftheOmicronSpiketrimerwithACE2andananti-Omicronantibody.

Science,2022.375(6584):p.

1048-1053.（40589-V08H26）美国、瑞士及德国的科研团队经体外和动物模型实验证实，D614G突变体比非突变病毒更占优势，其成果发表于国际著名期刊《Nature》病毒致病性、传播性等生物学特性研究病毒动物模型临床研究图片来自：DOI:

10.1038/s41586-021-03361-1D614G：40591-V02H3D614G：40591-V08H3义翘神州诊断试剂开发中的应用供应全球300家诊断试剂企业新冠Spike蛋白及突变体产品-支持血清学检测新冠、流感、RSV的N蛋白产品-支持病原学检测抗体特异性验证作为免疫原筛选高质量的抗体抗体覆盖度验证表位分析支持我国首批获准上市诊断产品产能达到kg级抗原检测试剂的质控品抗原检测方法的质控品义翘神州40591-V08H10S1（K417N,E484K,

N501Y,D614G）40591-V08H3S1(D614G)KIT004/KIT002抗体滴度检测试剂盒ELISAforplasma/seraHumoralimmuneresponsetocirculatingSARS-CoV-2variantselicitedbyinactivatedandRBD-subunitvaccines利用多种技术手段，分析了新冠病毒灭活疫苗（科兴）和RBD亚单位重组蛋白疫苗（智飞）接种者以及新冠感染康复者的血浆和诱导的中和抗体对于B.1.351突变体的免疫应答。分离的中和抗体对K417N/E484K/N501Y突变组合显示出中和性降低，其中E484K是主要原因。图片来自：YCaoetal,CellRes(2021)疫苗研究中的应用临床前研究（生物学效价、毒理）临床（生物学效价）质控（生物学效价）义翘神州Mengetal.(2011).PLoSOne.6(5):e19863.中国医学科学院，艾滋病研究中心题目：小鼠鼻内免疫重组蛋白HA和佐剂C48/80后能抵抗甲型流感病毒H1N1(2009)的攻击疫苗制备动物免疫效果评估实验流程实验详情及试剂使用蛋白疫苗的准备(HA蛋白:A/California/04/2009)肺组织的病理检测血清、鼻咽及肺部洗液等样品中的抗体检测(HA蛋白/ELISA)血清样品中的抗HA的IgE抗体的检测(HA蛋白/ELISA)血清中的中和抗体检测肺组织中的病毒载量检测激活后脾细胞的细胞因子释放的检测(HA蛋白/刺激脾细胞)动物免疫及取样详情疫苗研究中的应用义翘神州RSV疫苗研究中的应用腺病毒疫苗Ad26.RSV.preF（JanssenVaccines&PreventionB.V.）亚单位疫苗RSVpreF（Pfizer）核酸疫苗mRNA-1345（Moderna）Cat：11049-V08B在一项DNA疫苗的递送机制的研究中，利用义翘神州开发的RSV-F重组蛋白进行疫苗免疫后血清抗体滴度的检测，概述了一种高效、可耐受和安全的疫苗递送策略的临床前研究结果。doi:10.1016/j.vaccine.2017.04.008.Cat：40830-V08HLee及其团队在开发安全有效的RSV疫苗研究中，将义翘神州的RSV-G重组蛋白用做ELISA检测的包被抗原，检测血清中RSVA2病毒特异性抗体的滴度。doi:10.1016/j.vaccine.2014.08.045.义翘神州药物研究中的应用——新冠免疫原药物筛选动物实验和药物代谢Vir生物技术公司和华盛顿大学的研究人员发表在《Nature》上的报道，一种名为S309的单克隆抗体，具有识别SARS和SARS-COV-2的广谱性。即GSK的Sotrovimab前身。RBD-mFc:40592-V05HRBD-rFc:40592-V31H谢晓亮团队发表在《Nature》杂志中的首篇关于奥密克戎对中和抗体免疫逃逸的研究文章中，使用40592-V08H121进行抗体药的评价。DoraPintoetal.,Cross-neutralizationofSARS-CoV-2byahumanmonoclonalSARS-CoVantibody.Nature.2020,583(7815):290-295.Y.

Caoetal.,OmicronescapesthemajorityofexistingSARS-CoV-2neutralizingantibodies.Nature,

602

(2021),pp.

657-663,

10.1038/s41586-021-04385-3义翘神州药物研究中的应用——流感实验流程实验详情及试剂使用药物库准备体外筛选药物与靶点的相互作用实验流程实验详情及试剂使用RNA分子库准备药物改进HA蛋白/与药物共孵育RNA配体与HA的结合分析

(HA蛋白/与RNA配体共孵育)表面等离子共振技术分RNA配体与HA的结合(HA蛋白/与RNA配体共孵育)药效分析药物的衍生物制备及化学修饰题目：一种RNA配体抑制