抗独特型抗体及相关试剂盒开发技术

抗独特型抗体及相关试剂盒开发技术北京义翘神州科技股份有限公司SinoBiologicalInc.CONTENT抗独特型抗体研究背景1抗独特型抗体简介2抗独特型抗体及相关试剂盒开发流程3成功案例分享4SinoBiologicalInc.抗独特型抗体研究背景01SinoBiologicalInc.1975杂交瘤技术1985噬菌体展示文库技术1986鼠源抗体药物上市

2000ADC药物上市2011免疫检查点抗体药上市2021FDA累积获批上市抗体药物过百种1993嵌合型抗体药上市1997人源化抗体药上市2002全人源抗体药上市2009双特异性抗体药上市抗体类药物发展历程SinoBiologicalInc.●抗体类药物爆发式增长；

●全球抗体药市场节节攀升；

●新型抗体药物不断涌现；SinoBiologicalInc.抗体类药物开发的两个必需环节药代动力学实验（pharmacokinetics,PK)指导合理用药推进“精准医疗”安全性评价有效性评价抗独特型抗体——抗体药物开发过程中的重要配套试剂免疫原性评价(anti-drug-antibodyassayADA

assay)SinoBiologicalInc.抗独特型抗体简介02SinoBiologicalInc.抗体结构分析VHCH1VLCLCH2CH3AntigenbindingBiologicalactivityFR1FR2FR3FR4ForeignparticlebindingsiteForeignparticlebindingsiteCDR1CDR2CDR3SinoBiologicalInc.独特型（Idiotype）抗体分子可变区上的特异抗原表位群，主要是由于超变区的氨基酸的差异决定的抗独特型抗体（Anti-idiotypeAntibody,Anti-ID抗体）识别抗体独特型的抗抗体抗独特型抗体SinoBiologicalInc.抗独特型抗体分类抗原阻断型/竞争型Anti-ID抗体和抗体药的结合可以被靶标蛋白阻断抗原非阻断型/非竞争型Anti-ID抗体和抗体药的结合不被靶标蛋白阻断靶标蛋白Anti-ID抗体治疗性抗体药物靶标蛋白治疗性抗体药物Anti-ID抗体SinoBiologicalInc.抗独特型抗体的主要应用药代动力学研究——检测不同状态的抗体药物含量抗体类药物的免疫原性分析疫苗开发SinoBiologicalInc.药代动力学实验（PK）吸收中心区分布外周区代谢排除临床前初始药量设定分析药物相互作用及浓度监测临床安全性、有效性评价改进药物剂型、指导合理用药SinoBiologicalInc.抗独特型抗体在药物浓度检测中的应用抗独特型抗体捕获实验Anti-idiotypecaptureELISACaptureanti-idiotypeantibodySinoBiologicalInc.不同类型Anti-ID抗体在血药浓度检测中的应用抗原阻断型/竞争型Anti-ID抗体——检测游离抗体药和部分结合抗体药抗原非阻断型/非竞争型Anti-ID抗体——检测总抗体药靶标蛋白治疗性抗体药物Anti-ID抗体SinoBiologicalInc.结合型Binding与药物结合干扰PK、TK药物检测引起超敏反应保持/清除型Sustaining/clearing与药物形成复合物，延长/缩短药物半衰期延长/缩短药物暴露时间中和型Neutralizing与药物形成复合物，阻止药物和靶点的结合降低药效高低免疫原性（药物安评）：治疗性药物注入动物或人体内后，使其产生抗药抗体的反应性ADA的类型及危害：危害程度免疫原性评价SinoBiologicalInc.药物结构变化聚合、降解、氧化、脱酰胺等给药方式剂量、途径、频率与内源性蛋白的序列差异生产纯化工艺处方组分、生产条件受试人员个体差异遗传因素、健康状态储存、冷链运输各环节ADA原因多样后果严重公司名称靶点适应症终止阶段Abbvie/RocheIL2R多发性硬化症退市PfizerPCSK9降血脂PhaseIIITevaIL5哮喘PhaseIIIAZα4β1integrin肿瘤一线治疗PhaseIIIGenentechPD-L1肿瘤一线治疗PhaseIIIBMSPD1肿瘤一线治疗PhaseIIISinoBiologicalInc.基于风险的原则（Risk-based）具体问题具体对待（CaseByCase）多层次递进式进行（Multi-TieredTestingApproach）Tier1:ScreeningTier2:ConfirmationTier3:CharacterizationFinalpositivepositivenegativenegative免疫原性评价关键词SinoBiologicalInc.免疫原性检测方法设立原则高灵敏性（<100ng/mL）；可覆盖所有亚型ADA抗体检测（IgG、IgM、IgE等）；Anti-ID抗体作为阳性对照抗体，建立检测方法学验证；设立阴性个体对照（未给药个体、健康个体\目标疾病群体）免疫原性评价常用检测方法

桥联ELISA检测

放射免疫沉淀法(RIPA)

表面等离子共振技术(SPR)

电化学发光检测(ECL)抗体药Anti-ID抗体抗体药（标记后）SinoBiologicalInc.抗独特型抗体及相关试剂盒开发流程03SinoBiologicalInc.Anti-ID抗体类型的选择：单克隆抗体?多克隆抗体?项目Anti-ID单克隆抗体Anti-ID多克隆抗体主要应用范围PK检测免疫原性评价制备周期20~29周11~17周优势单一表位特异性好批次间稳定性好可以模拟血样中真实情况制备周期相对较短成本低劣势制备周期长成本相对较高不能反映血液样本的真实情况特异性偏低批次间稳定性低SinoBiologicalInc.1周免疫原制备9~11周动物免疫及效价检测2-5周杂交瘤细胞融合3-5周亚克隆筛选2-4周生产纯化2周抗体鉴定1周免疫原制备8-10周动物免疫及效价检测1-2周抗体纯化1周纯化后抗体鉴定Anti-ID单克隆抗体研发流程Anti-ID多克隆抗体研发流程SinoBiologicalInc.Anti-ID抗体研发技术难点分析动物免疫免疫原的选择；提高CDR区的免疫反应；快速免疫；单抗制备杂交瘤融合成功率；ELISA竞争分型检测方法；提高筛选效率的方法；纯化后抗体的鉴定方案；多抗纯化多克隆抗体纯化方案；如何选择纯化方式；SinoBiologicalInc.动物免疫-1.免疫原选择—IgG、F(ab)2免疫原IgGF(ab)2与同型IgG交叉反应+++免疫原成本+++与抗体药的识别+++单抗单次融合同时获得两种类型抗体的概率+++多抗纯化难度+++

根据实验具体需求，选择有优势的免疫原SinoBiologicalInc.动物免疫-2.提高CDR区免疫反应选用酶切后的F(ab)2进行免疫——减少Fc段引起的非特异性抗体比例；尝试多种免疫佐剂——弗氏佐剂、锰佐剂、QS21、titermax等；调整免疫部位、周期；尝试大分子蛋白偶联后免疫(KLH等)SinoBiologicalInc.动物免疫-3.快速免疫免疫方式小鼠兔常规免疫9~11周8~10周快速免疫4~5周5~7周SinoBiologicalInc.单抗-1.提高Anti-ID单克隆抗体融合成功率电融合技术获得更多融合成功的杂交瘤细胞增加Anti-ID抗体筛选几率靶点PEG融合电融合靶点1<1008倍靶点2<1002倍靶点3<1503倍靶点4<100相当靶点5040

相同脾细胞量电融合阳性克隆数量远大于PEG融合有效提高融合效率扩大抗体筛选池SinoBiologicalInc.单抗-2.Anti-ID

单克隆抗体的分型检测办法竞争ELISA检测原理1竞争ELISA检测原理2待检抗体抗体药小鼠IgG检测二抗靶点蛋白抗体药标记后靶点蛋白待检抗体靶点蛋白抗体药待检抗体人IgG检测二抗竞争ELISA检测原理3SinoBiologicalInc.细胞上清与纯化后抗体的竞争Elisa结果一致性好单抗-3.筛选阶段对Anti-ID

单抗进行初步分型:增加筛选的目的性SinoBiologicalInc.单抗-4.纯化后Anti-ID单克隆抗体鉴定方案结合检测竞争检测竞争型抗体；非竞争型抗体配对检测抗独特型抗体相互配对；抗独特型抗体与其他标记二抗配对兔抗小鼠F(ab)2/HRP抗独特型抗体B（标记）抗体药靶标蛋白抗体药物（血清样品）抗独特型抗体A抗独特型抗体与抗体药结合（+）；与同型人IgG/总人IgG结合（-）兔抗小鼠F(ab)2/HRP同型对照人IgG抗体药抗独特型抗体SinoBiologicalInc.多抗-1.Anti-ID多克隆抗体纯化方案1.蛋白A捕获总抗体2.免疫原亲和纯化3.总人IgG吸附4.同型人IgG吸附两步纯化法四步纯化法SinoBiologicalInc.多抗-2.Anti-ID多克隆抗体不同纯化方式的选择screeningconfirmationcharacterization可以检测总抗体针对非功能区的抗体也可能产生不良影响可以有目的的使用功能区抗体验证

根据实验阶段、实验需求的不同有针对性的选择纯化方式两步纯化法四步纯化法SinoBiologicalInc.Anti-ID相关试剂盒开发流程抗体亲和力筛选抗体标记抗体配对标曲建立样本检测、准确性验证检测方法建立及样本检测介入抗体亲和力筛选抗体配对标曲建立样本检测、准确性验证试剂盒生产及性能评估、验证稳定性准确性精密度灵敏度特异性试剂盒研发试剂盒生产、质控高品质的试剂盒SinoBiologicalInc.抗体药免疫原性试剂盒“01分析方法设计“02分析方法建立“03分析方法验证阳性对照抗体类型：多抗（推荐）或单抗种属：临床前（无特殊要求，多为兔源或鼠源）

临床（食蟹猴或其它非人灵长类）基质选择滴度曲线范围（棋盘法）

最小稀释倍数（MRD）试验条件试剂的准备临界值（筛选、确证、滴度临界值）灵敏度（与所用阳性对照密切相关）选择性及干扰精密度稳定性抗体药Anti-ID抗体抗体药（标记后）SinoBiologicalInc.抗体药血药浓度检测试剂盒抗独特型抗体B（标记）抗体药物（血清样品）抗独特型抗体A“01分析方法设计“02分析方法建立03分析方法验证类型：单抗(推荐）或多抗目标：竞争型抗体检测游离抗体药；非竞争型抗体检测总抗体药种属：无特殊要求，多为兔源或鼠源抗体配对筛选配对抗体最佳浓度（棋盘法）

检测灵敏度试验条件试剂的准备精密度稳定性基质干扰验证特异性耐用性“治疗性抗体药浓度定量方法——配体结合实验（LBAs）抗原捕获抗体检测（抗原捕获实验）抗原捕获抗原检测（桥联实验）抗种属抗体捕获&检测（通用实验）竞争实验Bioanalysis(2010)2(6),1125–1140AntigenDCompetitiveassayCGenericanti-humanlgGELISACaptureantispeciesantibodyAAntigen-captureELISASubstrateDetectionantibodyTherapeuticmAbConjugatedenzymeSignal(coloredproductorlightemission)CapturetargetantigenBBridgingassayAntigenAntigenSinoBiologicalInc.成功案例分享04SinoBiologicalInc.范例-1：Anti-ID单克隆抗体特异性好SinoBiologicalInc.范例-2：Anti-ID单克隆抗体竞争分型明确项目A项目B靶蛋白用量ug/ml靶蛋白浓度

ug/mlSino