血液等体液标本的细菌学检验鲍曼不动杆菌

关于血液等体液标本的细菌学检验鲍曼不动杆菌一、实验目的（一）掌握血标本的采集方法、检验程序（二）掌握鲍曼不动杆菌的分离培养与鉴定。（三）熟悉鲍曼不动杆菌的菌落特点、菌体形态及染色性。第2页,共25页，星期六，2024年，5月二、实验器材和试剂器材：酒精灯、火柴、取菌环、载玻片、普通光学显微镜、血平板试剂：3%过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、生理盐水、生化管药敏纸片：哌拉西林/他唑巴坦PIP/TA、替卡西林+克拉维酸TIC/CA、头孢他啶CAZ、头孢吡肟FEP、头孢噻肟CTX、头孢曲松CRO、阿米卡星AN、妥布霉素TM、美罗培南MPN、环丙沙星CIP第3页,共25页，星期六，2024年，5月三、实验内容（一）菌落观察（二）革兰染色法（三）氧化酶试验（四）接种生化管（五）菌种的综合判断第4页,共25页，星期六，2024年，5月四、实验步骤1、标本采集菌血症患者病原菌是周期性出现在血液中，尽管临床症状可能很严重，但患者血液中病原菌浓度水平相当低，因此要求临床多次采血液标本进行肉汤增菌培养，但24小时内一般不超过3次。怀疑为菌血症的患者，原则上应在抗菌药物使用前采取，对已开始抗菌药物治疗的患者可在下次给药前采取，标本大多由肘静脉采取，多部位采集血液标本也可增加阳性率。第5页,共25页，星期六，2024年，5月标本采集注意事项：

采血部位的皮肤消毒采用三步消毒法：即先用70%酒精擦拭皮肤，再用碘酒消毒，然后用70%酒精脱碘。采集的血液标本应分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养）和硫乙醇酸钠肉汤（厌氧培养）培养瓶中。硫酸镁葡萄糖肉汤中和多种抗生素，硫乙醇酸钠肉汤含有硫乙醇酸钠、葡萄糖等还原剂吸收其中的氧，为厌氧菌提供较低的氧化还原电位。血液与培养基的比例应为1：5—1：10儿童婴幼儿一般1-5ml成人一般10ml第6页,共25页，星期六，2024年，5月3、常见致病菌检验及报告方式（1）将血液细菌培养瓶置35度孵育，每日观察一次，连续观察至第七天。注意观察血液细菌培养瓶的变化。（2）如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查。如发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告（电话通知主管医生）。（3）根据涂片结果选择相应的抗菌药物，直接从血培养瓶抽取适量液体做初步药敏试验，并于18—24小时后报告初步药敏结果。第7页,共25页，星期六，2024年，5月（4）如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。包括需氧培养、真菌培养及厌氧培养。第8页,共25页，星期六，2024年，5月（5）对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染色性。革兰阴性杆菌：进行氧化酶试验并接种KIA培养基、O/F试验、生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验。革兰阳性球菌：葡萄串样或散在存在，触酶试验阳性，初步判断为葡萄球菌；触酶阴性链状或散在排列初步判断为链球菌属或肠球菌属，作生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验。第9页,共25页，星期六，2024年，5月血液标本中常见的细菌革兰阳性球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、A群、B群链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、厌氧链球菌、革兰阳性杆菌：产单核李斯特菌、炭疽芽胞杆菌、产气荚膜杆菌。革兰阴性球菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌。革兰阴性杆菌：大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌等。第10页,共25页，星期六，2024年，5月（6）报告方式在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有XX细菌生长”；经分离培养、生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养X天，有XX细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至七天，培养瓶中仍无细菌生迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌培养七天，无细菌生长”。第11页,共25页，星期六，2024年，5月注意事项1、一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉汤增菌液。2、对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目接种后无菌生长，方可报告阴性。第12页,共25页，星期六，2024年，5月注意事项3、为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目接种两次，第一次在标本孵育12—18小时后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种羊血平板和巧克力琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。革兰染色提示真菌生长，应移种至沙氏平板，L型菌须转种高渗平板。第13页,共25页，星期六，2024年，5月注意事项4、血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据，但血液标本在采集、接种、运送过程存在潜在污染的可能，尤其在静脉穿刺术中，因此皮肤消毒应严格按规程操作。5、一般菌血症由一种细菌引起，但约5%-10%的菌血症患者是多菌性菌血症。第14页,共25页，星期六，2024年，5月自动血培养仪原理：自动血培养检测系统是检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳来作为血液中有无细菌的指标。检测技术有放射标记、颜色变化（CO2感受器）、荧光技术和压力检测等。自动血培养仪集培养、震荡和检测一体化。接种血液标本后，血培养瓶在培养、震荡的同时，由检测系统自动连续监测瓶中CO2的产生情况，所测得信号传送至电脑分析，绘制出每个瓶中微生物的生长曲线。一旦出现阳性结果，电脑自动报警，指示阳性瓶的位置。第15页,共25页，星期六，2024年，5月血培养瓶厌氧瓶成人需氧瓶小儿需氧瓶第16页,共25页，星期六，2024年，5月全自动血培养仪第17页,共25页，星期六，2024年，5月自动血培养仪特点自动血培养仪除了适用血培养外，还可以用于其他无菌部位标本如脑脊液、胸腹水、和关节液等的细菌和真菌培养的检测。自动血培养仪与手工系统相比，提高了阳性检出率，灵敏度高，操作简单，能节省人力，缩短检验周期，一般培养5天。但仪器、设备和消耗品的成本较高。第18页,共25页，星期六，2024年，5月鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。是医院感染的重要病原菌。近年来的感染在增多，且其耐药性日益严重，对危重患者及ICU中的患者威胁很大。第19页,共25页，星期六，2024年，5月

鲍曼不动杆菌在医院感染中占第四位成为仅次于铜绿假单胞菌的又一个非发酵菌，位居第二。在某些地方不动杆菌的感染甚至已超过了铜绿假单胞菌。随着广谱抗菌药物的广泛使用，多重耐药不动杆菌日趋增多，耐药株对目前使用的所有抗菌药物均可耐药，且很容易通过交叉感染在医院内爆发流行。

第20页,共25页，星期六，2024年，5月步骤和方法1、形态观察革兰阴性、球状或球杆菌，常成双排列。2、菌落观察在血平板上形成圆形、凸起光滑、边缘整齐、不透明、灰白色、有粘性的菌落。菌落较小，在麦康凯上生长良好，形成无色或淡粉红色菌落。第21页,共25页，星期六，2024年，5月步骤和方法3、生化反应（1）氧化酶、触酶试验:氧化酶阴性、触酶试验阳性（2）其他生化反应：不发酵糖类，硝酸盐还原试验阴性，动力阴性第22页,共25页，星期六，2024年，5月药物敏感试验

对于不动杆菌属，首选抗菌药物为头孢他啶、哌拉西林、替卡西林、次选阿米卡星、亚胺培南、环丙沙星。鲍曼不动杆菌对全部氨基青霉素，第一代、第二代头孢菌素和第一代喹诺酮类抗生素天然耐药。目前治疗多选用β-内酰胺类药物+氨基糖苷类联合用药第23页,共25页，星期六，2024年，5月药敏纸片抑菌圈直径头孢他啶CAZ

≤1415-17≥18头孢吡肟FEP≤1415-17≥18头孢噻肟CTX

≤1415-22≥23头孢曲松CRO

≤1314-20≥21美洛培南MPN≤1314-15≥16妥布霉素TM

≤1213-14≥15阿米卡星AN≤1415-16