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文档简介

猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法26试剂6.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2℃~8℃保存。6.475%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20℃预冷。6.58mmol/LNaOH溶液，配制见附录A。6.6PBS缓冲液(0.01mol/LPBS,pH7.4),配制见附录A。6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL,Taq酶反应缓冲液中Mg²+浓度6.8dNTPs:含dATP、dGTP、dC6.9引物和TaqMan探针，其序列见附录B。6.10猪圆环病毒2型阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，-20℃保存备用；阴性对照可采用健康猪的组织材料。7样品采集和处理7.1采样工具7.1.3真窒采血管。7.2样品来集7.2.1血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少手-5mL,置于无菌离心管内，室温或者37℃倾斜放置自然凝集20min～30min,2000r/min～3000r/min离心10min,吸取上清液到新的离心管内备用。7.2.2粪便样品采集。取猪新鲜粪便1g,装入15mL灭菌离心管中，加人5mLPBS,混匀。7.2.3精液样品采集：按照GB/T25172的方法采集和保存精液7.2.4组织样品采集：采取病死猪(包括流产的死胎)或扑杀猪主要脏器(淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏)装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。7.2.5细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次，第3次解冻后，将细胞培养物置于1.5mL无DNA酶的灭菌离心管内，编号备用。7.3样品保存和运输上述采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃~8℃下保存应不超过24h,-20℃±5℃可以稳定保存3个月，-70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。7.4样品处理7.4.1血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。7.4.2粪便样品：3000r/min离心10min,取上清液，转入1.5mL离心管中，用于后续的核酸提取。35min,取上清用于后续的核酸提取。8荧光PCR操作程序8.1DNA抽提8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数十阳性对照+阴性对照，对每个离4℃或室温10000F/min离心5min。8.2荧光PCR检测在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为为待检样品数斗阳性管数+阴性管数，每个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失，建议按n+1个反应进行配制。配制反应液在冰盒456引物和探针名称序列PCV2-P(探针)5'-FAM-CCGCTCACTT

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