分离分析技术课件

分离分析技术5.分离分析技术5.分离分析技术

分离（separation）的概念含有m种化学组分的混合物被分成m个常量范围。把m种化学组分分成m种纯的形式，并把它们置于m个独立的容器中。利用混合物中各组分在物理或化学性质上的差异，通过适当的装置或方法，使各组分分配至不同的空间区域或者在不同的时间依次分配至同一空间区域的过程。什么是分离5.分离分析技术可用于分离的物质性质物理性质力学性质密度、摩擦因素、表面张力、尺寸、质量热力学性质熔点、沸点、临界点、蒸汽压、溶解度、分配系数、吸附电磁性质电导率、介电常数、迁移率、电荷、淌度、磁化率输送性质扩散系数、分子飞行速度化学性质热力学性质反应平衡常数、化学吸附平衡常数、离解常数、电离电位反应速度反应速度常数生物学性质

生物亲和力、生物吸附平衡、生物学反应速度常数分离方法的类型5.分离分析技术分类一：按被分离物质的性质1.物理分离法－按被分离组分在物理性质上的差异，采用适当的物理手段进行分离。

如：离心分离、电磁分离。2.化学分离法－按被分离组分在化学性质上的差异，通过适当的化学过程使其分离。

如：沉淀分离、溶剂萃取、色谱分离、选择性溶解。3.物理化学分离法－按被分离组分在物理化学性质上的差异进行分离。

如：蒸馏、挥发、电泳、区带熔融、膜分离。分离方法的类型5.分离分析技术分类二：按分离过程的实质1.平衡分离过程－使原混合物系形成新的相界面。利用互不相溶的两相界面上的平衡关系使均相混合物得以分离。

如：蒸馏、升华、超临界萃取、固相萃取、吸附。2.速度差分离过程－强化特殊梯度场。用于非均相混合物的分离。

如：沉降、离心、电泳、透析、反渗透。3.反应分离过程－促进化学反应达到分离。

如：沉淀、离子交换、反应晶析、反应萃取。分离方法的类型5.分离分析技术色谱法5.分离分析技术色谱法（Chromatography）是一种分离分析方法，它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。色谱法5.分离分析技术历史茨维特(M.S.Tswett1872-1919)俄罗斯植物学家色谱学之父以他的名字命名的Tswett奖，是色谱界的最高荣誉奖。

5.分离分析技术历史1940s纸色谱（paperchromatography，PC）1950s薄层色谱（thinlayerchromatography，TLC）1950s气相色谱（gaschromatography，GC）1960s高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）1970s毛细管气相色谱（capillarygaschromatography，CGC）1980s毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE）5.分离分析技术1948,8daysseparationfor16aminoacids色谱的发展5.分离分析技术1958,22hoursseparationfor19ofaminoacids色谱的发展5.分离分析技术1982,lessthan30minutesseparationfor18ofaminoacids色谱的发展5.分离分析技术（一）从两相的状态分类：色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。色谱的分类5.分离分析技术（二）按分离原理分类：吸附色谱法：利用吸附剂（固定相一般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别进行分离的方法；分配色谱法：利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同进行分离的方法。离子交换色谱：利用溶液中不同离子与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分离的方法。尺寸排阻色谱法：利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法。亲和色谱法：利用不同组分与固定相（固定化分子）的特异性亲和作用进行分离的方法。色谱的分类5.分离分析技术色谱的分类（三）按固定相的形式分类：按固定相的状态可分为：柱色谱：固定相装在色谱柱中；纸色谱：利用滤纸作载体，吸附在纸上的水作固定相；薄层色谱：将固体吸附剂在玻璃板或塑料板上制成薄层作固定相。5.分离分析技术

纸色谱示意图溶剂前沿起始线（原点）展开剂yx2x1层析缸层析纸纸色谱5.分离分析技术定性检出氨基蒽醌试样中的各种异构体样品：氨基蒽醌固定相：

-溴代萘附着于滤纸纤维素上.展开剂：吡啶:水（1:1）1,7-氨基蒽醌1,6-氨基蒽醌1,8-氨基蒽醌1-氨基蒽醌硝基蒽醌溶剂前沿原点纸色谱5.分离分析技术色谱的工作过程5.分离分析技术色谱流出曲线色谱流出曲线（chromatogram）指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。当待测组分流出色谱柱时，检测器就可检测到其组分的浓度，在流出曲线上表现为峰状，叫色谱峰。5.分离分析技术下图是两个物质经过不同色谱柱后的流出曲线，请问哪个好？ABCD5.分离分析技术气相色谱5.分离分析技术

H2,N2或Ar气路系统进样系统检测系统分离系统温控系统气相色谱仪的结构五大系统5.分离分析技术气相色谱仪的结构一、气路系统获得纯净、流速稳定的载气。载气要求化学惰性，不与有关物质反应。

二、进样系统以进样器（微量注射器或六通阀）将样品注入气化室(汽化室温度比样品中最易蒸的物质的沸点高约50oC)5.分离分析技术气相色谱仪的结构三、分离系统色谱柱：填充柱、空心毛细管柱填充柱：制备简单，可供使用的单体，固定液，吸附剂繁多，可解决各种分离分析问题。填充柱外形有U型，和螺旋型两种，内径均为2～4mm，长度在1～3m之间。可由不锈钢，玻璃，聚四氟乙烯等制成。空心毛细管：分析速度快，样品用量少，柱容量低，内径为0.1～0.5mm，长为50～300m，其外形多为螺旋型，材料：玻璃，尼龙，不锈钢。5.分离分析技术气相色谱仪的结构四、控温系统温度控制是否准确，升、降温速度是否快速是市售色谱仪器的最重要指标之一。控温系统包括对三个部分的控温，即，气化室、柱箱和检测器。控温方式：恒温和程序升温。5.分离分析技术1.热导检测器(TCD);2.氢火焰离子化检测器(FID);3.电子捕获检测器(ECD);4.火焰光度检测器(FPD);5.氮磷检测器（NPD）也称热离子检测器(TID);6.原子发射检测器(AED);7.硫荧光检测器（SCD）气相色谱仪的结构五、检测和放大记录系统5.分离分析技术根据检测器的响应原理，可将其分为浓度型和质量型检测器。浓度型：检测的是载气中组分浓度的瞬间变化，即响应值与浓度成正比。质量型：检测的是载气中组分进入检测器中速度变化，即响应值与单位时间进入检测器的量成正比。气相色谱仪的结构5.分离分析技术气相色谱固定相可分为两类：1）用于气液色谱的固定相：固定液+载体2）用于气固色谱的固定相：固体吸附剂气相色谱固定相5.分离分析技术气液色谱固定相

气液色谱固定相——载体

载体为固定液提供大的惰性表面，以承担固定液，使其形成薄而匀的液膜。5.分离分析技术气液色谱固定相

气液色谱固定相——固定液

对固定液的要求：

a)热稳定性好、蒸汽压低——流失少

b)化学稳定性好——不与其它物质反应

c)对试样各组分有合适的溶解能力（分配系数K适当）

d)对各组分具有良好的选择性固定液选择：按“相似相溶”原理选择固定液。非极性组分——非极性固定液极性物质——极性固定液Ps:相对极性P：规定非极性固定液角鲨烷的极性为0，强极性固定液

,-氧二丙腈的极性为100，其余物质的P在0～100之间，每20单位为一级，即将极性分为5级：0～+1(非极性)；+2(弱极性)；+3(中等极性；+4～+5(强极性)5.分离分析技术气液色谱固定相5.分离分析技术气固色谱固定相

气固色谱固定相——固体吸附剂

该类型色谱柱是利用其中固体吸附剂对不同物质的吸附能力差别进行分离。主要用于分离小分子量的永久气体及烃类。常用的固体吸附剂：硅胶(强极性)、氧化铝(弱极性)、活性炭(非极性)、分子筛(极性，筛孔大小)5.分离分析技术气固色谱固定相5.分离分析技术液相色谱5.分离分析技术

气相色谱与液相色谱1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%

LC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%GC与LC5.分离分析技术

2．流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。

3．操作条件差别GC：加温操作LC：室温（液体粘度大，峰展宽小）GC与LC5.分离分析技术HPLC与LC1．高速HPLC：高压！2．高效HPLC：颗粒极细、规则均匀的固定相3．高灵敏度HPLC：高灵敏检测器5.分离分析技术HPLC的主要类型5.分离分析技术HPLC的主要类型SO3H+M+

SO3M+H+

5.分离分析技术Agilent11005.分离分析技术5.分离分析技术对于未知的复杂样品，如何知道流出的每个峰对应于什么物质？5.分离分析技术气/液-质联用5.分离分析技术质谱质谱法（massspectrometry,MS）是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比（m/z）大小进行分离记录的分析方法，所得结果即为质谱图（massspectrum）。质谱法的主要作用是：（1）准确测定物质的分子量（2）根据碎片特征进行化合物的结构分析

在鉴定有机物的四大重要手段（NMR、MS、IR、UV-vis）中，也是唯一可以确定分子式的方法。

5.分离分析技术1、进样化合物通过汽化引入离子化室2、离子化在离子化室，组分分子被一束加速电子碰撞（能量约70eV），撞击使分子电离形成正离子；M——M++e或与电子结合，形成负离子M+e——M-原理5.分离分析技术4、荷电离子被加速电压加速，产生一定的速度v，与质量、电荷及加速电压有关：原理3、离子也可因撞击强烈而形成碎片离子5.分离分析技术3、分离管为一定半径的圆形管道，在分离管的四周存在均匀磁场。在磁场的作用下，离子的运动由直线运动变为匀速圆周运动。此时，圆周上任何一点的向心力和离心力相等。故：

R为圆周半径，H为磁场强度。

合并上述两式：原理5.分离分析技术质谱图5.分离分析技术色谱－质谱联用色谱：化合物分离质谱：纯物质结构分析色谱-质谱联用：分离-分析SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDChromatographMassSpectrometerSeparationIdentificationBACDADBCMSGC/LC-MS5.分离分析技术色谱质谱联用仪关键点：接口技术GC-MS的“接口”：常采用喷射分子离子分离器。GC-MS接口：除去载气，只让组分分子进入离子源。LC-MS的“接口”：常采用离子喷雾、电喷雾技术。LC-MS接口：除去流定相，只让组分分子进入离子源。GC/LC-MS5.分离分析技术岛津GCMS-QP2010气质联用仪GC/LC-MS5.分离分析技术GC/LC-MS谱图总离子流色谱图（TotalIoncurrentchromatogram,TIC) 样品离子化后形成的各种离子（包括碎片离子）流强度随时间变化的曲线。横坐标：每种离子强度最大时对应的时间。纵坐标：每种离子产生信号的强度。质谱图GC/LC-MS谱图5.分离分析技术总离子流图和质谱图的关系GC/LC-MS谱图5.分离分析技术应用：苯烷基化反应产物的检测。仪器：HP6890GC-5973MS气质联用仪；色谱柱为HP-5MS弹性石英毛细管柱,30m×250μm×0.25μm；载气为氦气；电离方式为EI，离子源温度为230℃，电子能量为70eV.

气相色谱条件：进样口温度为310℃，接口温度为280℃，进样量为0.2μl，流速为0.8mL/min，分流比为50:1，柱温从100℃开始，以15℃/min升至300℃，保持2min。C6H6+RBrC6H5－R

（R=C14H29）应用实例——GC-MS5.分离分析技术苯烷基化产物的总离子流图t/min十四烷基苯的质谱图m/e应用实例——GC-MS5.分离分析技术应用：测定牛奶中4种四环素类药物残留量。

我国规定牛奶中四环素类的最大残留量0.1mg/Kg。应用实例——LC-MS美他环素金霉素四环素土霉素5.分离分析技术仪器：Finnigan公司LCQ型液相色谱－质谱联用仪，包括

ESI（电喷雾电离）源。

HypersilBDSC18(5μm,5.0mm×150mm)色谱柱.

条件:流动相为乙腈-水-甲酸（37.5:62.5:1.2），流速

0.5mL/min；离子源（ESI）喷射电压4.2Kv；氮气流速0.75L/min。四种四环素类药物色谱图应用实例——LC-MS5.分离分析技术四环素土霉素金霉素美他环素四种四环素类药物的质谱图应用实例——LC-MS5.分离分析技术定性分析：将待测样品（牛奶）进行LC-MS分析，与四种四环素类药物标准品的保留时间和质谱图进行对比分析。定量分析：标准曲线法（峰面积～浓度）。应用实例——LC-MS5.分离分析技术毛细管电泳5.分离分析技术经典电泳分析

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。经典电泳与毛细管电泳5.分离分析技术毛细管电泳分析

CapillaryElectrophoresis(CE)高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：

一是采用了50μm(0.05mm)内径的毛细管,

二是采用了高达数千伏的电压。

毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。经典电泳与毛细管电泳5.分离分析技术高效毛细管电泳普通色谱毛细管电泳与色谱5.分离分析技术1、高灵敏度：紫外检测器的检测极限在10-13—10-15mol之间，荧光检测可达10-19—10-21mol。2、速度快:许多分析在10分钟内完成。3、进样少:一般需要毫微升的进样量。4、成本低:一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液。5、应用范围广:有机物、无机物、生物、中性分子、生物大分子等。毛细管电泳的特点5.分离分析技术电渗现象与电渗流

electroosmosisandelectroosmoticflow

当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。

当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。

电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。

毛细管电泳的基本原理5.分离分析技术电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。

在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。毛细管电泳的基本原理改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。5.分离分析技术CE中电渗流的流形

电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。毛细管电泳的基本原理5.分离分析技术

各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：

ν+=ν电渗流

+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；

ν-=ν电渗流

-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；

ν0=ν电渗流

中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在CE中，控制电渗流非常重要。毛细管电泳的基本原理5.分离分析技术CE中影响电渗流的因素1.电场强度的影响：电渗流速度和电场强度成正比2.毛细管材料的影响

3.电解质溶液性质的影响4.温度的影响5.添加剂的影响毛细管电泳的基本原理5.分离分析技术淌度

mobility

淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；

淌度不同是电泳分离的基础。毛细管电泳的基本原理5.分离分析技术毛细管区带电泳

Capillaryzoneelectrophoresis，CZE

带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。

最基本、应用广的分离模式毛细管区带电泳5.分离分析技术毛细管凝胶电泳

Capillarygelelectrophoresis，CGE将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。其他毛细管电泳类型

在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定相，或在管内填充固定相，根据溶质在固定相和流动相中的分配系数的不同和自身的电泳淌度差异得以分离．毛细管电色谱(CEC)

Capillaryelectrochromatography胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）毛细管等电聚焦（CIEF）5.分离分析技术1.高压电源0～30

kV稳定、连续可调的直流电源；2.毛细管柱

（1）材料：石英；玻璃；聚四氟乙烯（2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度<=1m毛细管电泳仪3.缓冲液池4.检测器紫外-可见、荧光、激光诱导荧光、电导等5.分离分析技术离子分析

analysisofion阳离子分析

迁移方向和电渗流方向一致；

4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；毛细管电泳的应用5.分离分析技术阴离子分析

阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、