apoB多态性检测的方法(包括VNTR,Eco和MSP酶切多态性)

apoB基因多态性分析

apoB基因独立位于2号染色体短臂末端（2p23），单拷贝。基因全长43kb，含28个内含子和29个外显子。功能：载脂蛋白B（apoB）是VLDL、IDL和LDL的主要结构蛋白,其主要功能是转运内源性胆固醇,维持体内血胆固醇平衡。apoB基因在所有载脂蛋白基因中具有最明显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中导致氨基酸变异的有54处。一、apoB-VNTR3’VNTR位于该基因3’端下游第2个PolyA信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（minisatellite）。根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种ApoB基因3’VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在400～1200bp之间，根据重复序列的内部结构可以把这些重复序列分为两类：一类是ATAATTAAATATTTT，称为X型；另一类是ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T），又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。有关3’VNTR多态性PCR-VNTR(VariablenumbleoftandemlyrepeatedshortDNAsequence)多态性检测PCR；电泳检测有关PCR反应PCR反应体系PCR过程PCR的基本原理标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200μmol/L引物各10～100pmolTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L模板DNA0.1～2μgapoB-VNTRPCR反应引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5

μl总体积：30μl（1）PCR反应体系（2）PCR程序

94℃5min（预变性）

94℃60’’（变性）

60℃4min

（复性+延伸）

60℃5min（续延伸）4℃保存30cycle二、酶切位点多态性1.EcoRI酶切位点

apoB基因的EcoRI酶切位点多态性是由于4154位密码子突变，使原有的EcoRI酶切位点消失，产生E-等位基因，并使所编码的谷氨酸被赖氨酸取代。有研究认为具有突变的E-等位基因与血浆高胆固醇（TC）及高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平有关，与血浆甘油三酯(TG)、LDL-C水平升高相关。GAATTCCTTAAGEcoRI酶切位点多态性检测

PCR反应引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5

μl总体积：30μl（1）PCR反应体系（2）PCR程序

94℃5min（预变性）94℃1min（变性）

58℃3min

（复性+延伸）

72℃5min（续延伸）4℃保存30cycle酶切反应及电泳检测(1)酶切反应体系：

PCR反应产物10ul10XbufferEcoRI2ul双蒸水18ulEcoRI1ul(2)酶切反应时间：37℃12小时，最后65℃20min终止反应。

(3)电泳检测

2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果：EcoRI酶切位点出现E+E+(含253bp、227bp2条带)、E+E-(含480bp、253bp、227bp3条带)和E-E-(含480bp1条带)3种基因型。E-E-E-E+E+E+

2.MspI酶切位点多态性

对个体血脂影响不大，但由于它在CHD人群中出现频率较高，推测它与脂质代谢、CHD发病之间存在某种联系CCGGGGCCMspII酶切位点多态性检测

PCR反应引物1μlDNA模板1.5μlMix15μlddH2O12.5

μl总体积：30μl（1）PCR反应体系（2）PCR程序

94℃5min（预变性）94℃1min（变性）

60℃1min

（复性）72℃1min（延伸）

72℃5min（续延伸）4℃保存30cycle酶切反应及电泳检测(1)酶切反应体系：

PCR反应产物10ul10XbufferEcoRI2ul双蒸水18ulEcoRI1ul(2)酶切反应时间：37℃12小时，最后65℃20min终止反应。

(3)电泳检测

2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果：MspI酶切位点出现M+M+(含395bp、85bp2条带)、M+M-(含480bp、395bp、85bp3条带)和M-M-(含480bp1条带)3种基因型。M-M-M-M+M+M+

基因组DNA的琼脂糖电泳检测一、实验原理（1）琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解（84-96度），36-42℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度（分离0.2-50kb）；DNA分子在碱性缓冲液（pH8.0）中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带；DNA显色剂多用EB（致癌作用），它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光（防止损伤）照射下呈橘红色（530nm）的荧光；一、实验原理（2）电场强度：与电泳速度成正比；（DNA/蛋白质等大分子：100-500V，即常压电泳；高压电泳：氨基酸/核苷酸等小分子）溶液PH值：距等电点越远，净电荷越多，则速度越快；离子强度：越低则带电物质的速度越快。DNA分子量：越小则越快；DNA构象：超螺旋＞线性＞开环（质粒）胶浓度：越低则速度越快TAE缓冲液：超螺旋结构更符合其实际分子质量；TBE：缓冲能力强，适合≤1KbDNA片段上样缓冲液：EDTA—螯合镁，防止DNA降解；含有聚蔗糖—防止样品扩散；迁移指示剂--溴酚蓝相当于0.5Kb大小；二、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法掌握检测DNA的实验方法基因组DNA电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，EB（溴化乙锭）或EB替代物，6X加样缓冲液：Ⅰ0.25%溴酚蓝（指示剂，约500bp），0.25%二甲苯青（指示剂，约5000bp），40%蔗糖水溶液（比重加大，防止扩散）;Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液三、实验材料琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、2%胶3mm、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样（取基因组DNA样品液8μl+2μl上样缓冲液（5×），混匀,上样；）电泳（恒压100V1小时）检测（紫外检测）四.操作步骤（1人1孔）PCR扩增HBV基因产物的鉴定取PCR产物20μl直接上样14325671%胶，电泳（100V30min）1：Marker2：阳性模板3：待测样品14：待测样品25:待测样品16:待测样品27:待测样品18