LC-MS方法分析皮肤表面鞘脂的组成

背景介绍鞘脂（Sphingolipids）以鞘氨醇骨架为基本结构，是表皮中功能最丰富的一类脂质，在表皮屏障的形成和结构中起基础性作用。其中，神经酰胺是皮肤屏障的重要组成成分，约占角质层脂质含量的50%（质量分数），能防止表皮失水和环境中有害物质的渗透。因此，对皮肤表面鞘脂进行全面分析对于评估皮肤状态和屏障功能具有重要意义。目前，已经建立了皮肤表面神经酰胺等特定鞘脂类物质的高通量分析方法，但对皮肤鞘脂的全面分析尚未见报道。

文章亮点采用UPLC-Q-TOF-MS技术建立女性皮肤表面鞘脂全面分析的新方法，并应用于青、中年女性皮肤鞘脂的相对含量比较；探究鞘脂在皮肤衰老过程中的可能生理机制；为皮肤鞘脂的全面分析提供新方法，也对皮肤衰老机制的探索及相关抗衰老护肤品的研发提供理论依据。内容介绍1样品前处理方法的优化实验参考文献中前处理方法对皮肤样品中的鞘脂前处理方法进行优化。考察了不同提取溶剂体积（取文献方法提取溶剂体积的1/4、1/2、1、2、4倍）以及不同取样次数（2、3、4、5次）的影响。2皮肤表面鞘脂成分的鉴定根据鞘脂的结构特征，通过一级分子式匹配和二级质谱结构解析，在女性前臂皮肤上一共鉴定得到108个鞘脂。其中包括16个鞘氨醇（Sa）、18个双氢鞘氨醇（So）、65个神经酰胺（Cer）、8个1-磷酸神经酰胺（CerP）和1个磷酰鞘脂（PN-Cer）。对不同表皮层数的脂质进行检测时发现，鞘磷脂和葡萄糖神经酰胺在皮肤表面的含量极低、甚至为零，而本实验在皮肤表面鞘脂的鉴定时，也未发现这两类物质。鞘氨醇碱的鉴定以Sa(d25:0)为例（图1a），其[M+H]+通过依次丢失H2O得到m/z

382.4038和m/z

364.3934两个特征碎片，在此基础上丢失HCHO产生的m/z

352.3943碎片离子也可辅助证明该鞘氨醇结构中含有两个羟基。神经酰胺的鉴定主要基于其鞘氨醇骨架产生的特征碎片，以Cer(t17:0/26:0)为例（图1b）。图1

代表性皮肤表面鞘脂的MS/MS图谱Fig.1

MS/MSspectraofrepresentativeskinsurfacesphingolipids3多元变量统计分析在青、中年组女性前臂鞘脂的比较研究中，通过OPLS-DA分析（图2a）得到各个特征离子的VIP值，再由Student’s的t检验计算各特征离子丰度在两组间的显著性差异。筛选VIP值＞1、且p值＜0.01的特征离子作为差异性代谢物，并绘制了差异性鞘脂在两组中相对含量的热图。由图3可知，青、中年组之间共找出了43种差异性鞘脂。与青年组相比，中年组中So、Cer、CerP和部分Sa的含量升高，而部分Sa含量呈下降趋势。随后，采用PCA方法来验证所筛选的差异性鞘脂对两组区分的效果。图2b中每个点代表一个样本，可发现所有样本均处于置信区域内，青、中年组之间显示出明显的分离情形，PC1和PC2的贡献率分别占79.1%和8.0%，对于组间分离具有较高的贡献率。图2

多元变量统计分析结果Fig.2

Resultsofmultivariatestatisticalanalysis图3

青年组（Y）与中年组（M）的差异性鞘脂相对含量热图Fig.3

Heatmapbasedonthenormalizedrawabundanceofdifferentialsphingolipidsofyoung(Y)and

middle-aged

group(M)4结论本文建立了一种基于UPLC-Q-TOF-MS的鞘脂全面分析方法，对不同年龄女性前臂皮肤表面的108个鞘脂进行了结构鉴定，并对不同种类代表性鞘脂的碎裂机理进行了细致讨论。将该方法应用于青、中年组女性皮肤鞘脂的检测，结合多元变量统计分析，发现两组鞘脂变化呈明