RNA在病原微生物检测中的应用

RNA在病原微生物检测中的应用

摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结

病原体检测方法分类以看到“整个病原体”为基础的方法镜检，培养以直接或间接看到“病原体组分－蛋白质”为基础的方法免疫学胶体金，Elisa,化学发光，etc以看到“病原体组分－核酸”为基础的方法

分子生物学分子诊断概念和特点概念：利用标本中的核酸作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判断的方法。特点：特异性高、灵敏度高诊断范围广、适应性强什么是核酸？链状分子DNA(脱氧核糖核酸)

贮存遗传信息RNA(核糖核酸)

传递遗传信息遗传信息的传递途径DNARNA蛋白质转录逆转录DNAvs.RNA（一）DNA是双螺旋结构，RNA是单链结构DNA很稳定，RNA很不稳定DNAvs.RNA（二）有些RNA在细胞中拷贝数很多

一个或几个拷贝DNA104核糖体RNA(rRNA)16SrRNA23SrRNA使用rRNA为靶标，可以大大提高了取样效率和检测灵敏度。常见的RNA检测技术NASBA（国外）TMA（国外）SAT（国内）SAT技术原理①②③④同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝。然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况；同时，每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。

SAT与PCR技术原理比较

RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分钟内扩增1010倍RNADNASAT配套仪器(全自动工作站)样本---提取纯化RNA---酶反应混合液（一体化）全封闭生物安全性好快（48个样本/2.5小时）摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结DNA用于临床检验的不足“死菌检测也阳性”，与临床相关性差基因型与表型不吻合(耐药检测)

不能区分“潜伏感染”“活动性感性”

易交叉污染

反应易受抑制SAT检测靶标为16SrRNA灵敏度更高

RNA在细胞中拷贝数很多，细菌中16srRNA多达10000-20000个

一个或几个拷贝DNA10416srRNAJensen,1994-16SrRNA具有高度保守性不同来源MG的16SrRNA区域，PCR产物序列同源性100%，准确区别不同病原体SAT检测靶标为16SrRNA检测特异性高16SrRNA长度适中，适合做探针，检测更准确其编码基因长度约为1500bp,包含50个左右功能域RNA诊断（TMA、SAT）具有非常高的灵敏度和准确度Gen-probe:RNA检测罗氏:DNA检测与DNA相比，RNA检测更利于疗效评估及判愈DNA双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有“死菌”残留，人体内完全代谢需2-3周时间

<<中国性病诊疗指南>>中指出，如用PCR方法进行判愈，需在疗程结束后3-4周。RNA单链结构，易降解，病原体死亡后2-3天后完全降解与临床相关性好，=“培养”，有利于疗效评估和及时判愈有些情况下，可以直接诊断“活动性感染”

活动性感染：指示RNA转录活跃潜伏感染：指示RNA不转录能检测多种样本类型，比如尿液等，取样方便。数据来源：M.Chernesky,D.Jang,K.Luinstra,etal.2006.HighAnalyticalSensitivityandLowRatesofInhibitionMayContributetoDetectionofChlamydiatrachomatisinSignificantlyMoreWomenbytheAPTIMACOMBO2Assay.J.Clin.Microbiology44(2):400-405.反应不易受抑制SAT诊断技术对于病原体检测中的优势SAT产品特点SAT的优势带给临床的益处检测靶标：16SrRNA灵敏度高,特异性更强活菌检测反映临床用药的疗效结果准确度高早期诊断检出率高用药治疗后准确及时的判愈扩增产物：RNA产物易降解，减少实验室污染风险维护实验室质控水平反应不易受抑制检测样本多样化（拭子、尿液）取样方便提高了医生的工作效率减轻了病人取样带来的痛苦扩增方式：42℃恒温降低实验室设备要求缩短检测时间自动化操作更易实现报告更快速、更准确避免了人工操作带来的误差摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结

国内外RNA诊断产品监管机构认可情况国外：FDA或CE认证产品（TMA）国内：SFDA认证产品（SAT）沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）生殖支原体（MG)核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）肠道病毒71型（EV71）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）肠道病毒（EV）通用型核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）肺炎支原体（MP）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）......为什么我们必须熟悉和了解RNA检测技术？（一）

为什么我们必须熟悉和了解RNA检测技术？（二）血液筛查市场美国中国RNA诊断RNA诊断传统技术传统技术其他传染病市场（优生优育：CT/NG为例）RNA诊断传统技术传统技术美国中国100%进口！有部分国产

国内外RNA诊断产品应用情况RNA用于CT/NG的检测（TMA）是目前行业公认的“金标准”

为什么我们必须熟悉和了解RNA检测技术？（三）TMA（APTIMACombo2）被广泛的应用于CT/NG检测。在美国，85%的顶级医院使用TMA进行CT/NG检测没有竞争对手可以超过TMA，是目前市场上最好的CT/NG检测产品新方法学CT/NG的产品临床试验都必须选择TMA（APTIMACombo2）做参比试剂数据来源于Internaltraining，Gen-probeRNA用于TB的检测（TMA）进入多国诊疗指南2009：美国CDC更新NAAT法在TB实验室诊断中应用的指南——所有疑似TB的初诊病人，除了做涂片之外，都必须用TMA检测至少一份样本。（TMA获得FDA认证可检测涂阴、涂阳标本，PCR只获得FDA认证可检测涂阳标本）为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（四）UpdatedGuidelinesfortheUseofNucleicAcidAmpflicationTestintheDiagnosisofTuberculosis(2009)UnitedStates

摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状SAT扩增技术在生殖道支原体检测优势结论国内唯一上市MG诊断试剂结果准确

检测靶标—16SrRNA，灵敏度高，特异性强取样方便女性：阴道拭子、宫颈拭子、尿液

男性：尿道拭子、尿液疗效判愈

检测靶标为RNA

只有“活菌”RNA才能被检测

治愈后2-3天，RNA在体内完全降解

上市时间—2014年4月SAT检测MG阳性的患者与测序基本一致对女性尿液和宫颈拭子同时检测进行

SAT检测结果与测序结果分析如下测序结果合计阳性阴性尿液和宫颈拭子SAT结果阳性43043阴性5249254合计48249297阳性符合率=43/（43+5）*100%=89.58%阴性符合率=297/（297+0）*100%=100%准确度=（43+249）/297*100%=98.32%SFDA唯一批准可用于尿液检测的核酸试剂对女性同一患者的尿液样本和宫颈拭子样本同时检测与尿液和阴道拭同时检测SAT检测结果对比分析如下尿液和阴道拭子MG-SAT结果合计阳性阴性尿液和宫颈拭子MG-SAT结果阳性39443阴性5249254合计44253297女性同一患者样本一致性符合率=(39+249)/297*100%=96.97%SAT检测利于用药监测与判愈RNA很快降解用药监测和判愈提高医院诊疗水平降低患者诊治成本检测方法可否监测原因镜检法否不能判断是否活菌培养法是尽管活菌才能培养，但灵敏不足金标法否假阴性率偏高PCR否有效治疗后,细菌DNA至少需要3周降解SAT是有效治疗后,细菌SAT—MG检测给临床带来意义

特点获益兼顾拭子及尿液样本检测1扩大了患者类型（孕妇、未婚女性及未成年人）2减轻病人痛苦，保护隐私（男性患者）3降低了医生的工作量4无创式取样，减少取样带来的风险靶标为16SrRNA灵敏度高、特异性强，保证了结果的准确性，提高了医院的诊疗水平，避免了诊断错误带来的医疗纠纷病原体死亡，RNA很