激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程

第第页激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程

（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。

成像原理

接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。

基本结构

（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

（1）扫描模块

扫描模块紧要由针孔光栏（掌控光学切片的厚度）、分光镜（按波长更改光线传播方向）、发射荧光分色器（选择确定波长范围的光进行检测）、检测器（光电倍增管）构成。荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图象，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图象及其合成图象。

（2）荧光显微镜系统

显微镜是LSCM的紧要组件，它关系到系统的成像质量。显微镜光路以无限远光学系统可便利地在其中插入光学选件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色差物镜，有利于荧光的采集和成像的清楚。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调整，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动掌控。

激光扫描共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点：需与扫描器连接，使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器；需有光路转换装置，即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。

（3）常用激光器

激光扫描共聚焦显微镜使用的激光光源有单激光和多激光系统，常用的激光器包括以下三种类型：

半导体激光器：405nm（近紫外谱线）

氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm（蓝绿光）

氦氖激光器：543nm（绿光—氦氖绿激光器）633nm（红光氦氖红激光器）

UV激光器（紫外激光器）：351nm、364nm（紫外光）

（4）辅佑襄助设备

风冷、水冷冷却系统及稳压电源。

激光扫描共聚焦显微镜的基本工作原理是首先由激光器发射的确定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应的被照射点受激发而发射出的荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机监视屏上。这样由焦平面上样品的的每一点的荧光图像构成了一幅完整的共焦图像，称为光切片。

倒置荧光显微镜的适用倒置荧光显微镜是指与一般显微镜相比，其物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，由荧光附件与显微镜有机结合构成的显微镜。

激发光从物镜向下落射到标本表面，被反射到物镜中并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，经双色束分别器使激发光和荧光分开而成像。

物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培育皿中的被检物体进行显微察看和讨论。

适用于土壤微生物培育试验，具有在培育瓶或培育皿内进行显微察看的特点，可以察看不经染色的透亮活体。

特别适用于对活体细胞和细胞离体培育等显微察看。

高信噪比（S/N），能够捕获极弱荧光

光学品质——对现代生命科学讨论至关紧要

荧光察看的理想情况是接受最低量的激发光照射捕获高对比度的图像，由此将细胞受损及荧光衰减的机会降至最小。

对UIS2系统的物镜进行精密的设计，使用微弱的激发光即可捕获光亮的荧光图像。光透过率进步的同时也提高了UIS2光学系统的信噪比。

干涉镀膜荧光激发块的性能改进荧光激发块的干涉膜接受了新型镀膜技术，激发带宽（BP）以及荧光带宽（BA）比传统谱线缩短了6nm，使信噪比更进一步得到提高。

荧光激发块接受硬镀膜技术，大大延长了激发块的使用寿命，提高了在潮湿环境中的使用性能。

荧光蛋白专用高质量荧光激发块

BX2系列HQ型荧光激发块较为适合的波长是ECFP/EFP/EYFP/DsRed。高锐化镀膜以及高透过率（90%—95%）可有效地透过荧光蛋白所发射的荧光。

这样，即使接受微弱的激发光仍可察看到光亮的图像，同时，防止荧光衰减，并将细胞受损的可能减至最小。

削减杂散光的功能

当在分光镜对激发光进行反射时，杂散光的微量透射就可造成噪声上升。

荧光激发块经由其独特的光吸取涂层可吸取99%以上的杂散光，削减信号干扰，获得高质量图像。

荧光成像用高数值孔径物镜

BX2系列具有新研制的PLAPON60XO物镜的特点，