《药品生物检定技术》教案

《药品生物检定技术》教案第1次课２学时章节第一章供试品溶液的配制第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1．明确药品生物检定的概念和任务。2．掌握供试品（固体）溶液的配制。3．熟悉实践操作。教学重点难点【重点】1．药品生物检定技术的概念和任务。2．供试品（固体）溶液的配制。3．实践操作。【难点】供试品溶液的配制教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学【教学内容】《药品生物检定技术》课程简介(20分)本课程主要讲授供试品溶液的配制、双碟的制备、无菌检查、药品的微生物总数检查、控制菌及螨类检查、抗生素效价的微生物检定法、毒力及异常毒性检查热原及细菌内毒素检查、胰岛素的生物检定、几种药品的生物活性检定、升降压物质检查的原理、方法和注意事项。教学目的及要求要求学生掌握常用方法的原理以及操作技能。具备独立完成药品检验的实际工作能力，能在检验过程中根据药品质量标准的要求，严格按照药品检验标准操作规范进行操作，全面控制药品质量。学习方法与要求（1）在充分理解的基础上，掌握好课程中讲述的有关基本概念与基本原理，并能融会贯通，加以应用。（2）熟练掌握有关实验的基本操作与方法，学会对实验现象进行分析、总结、报告。（3）实验操作要严格按中国药典要求或标准操作规范进行操作，认真细致地进行观察，避免与减少实验误差。（4）培养高度的责任感和严谨的科学态度，学习、工作时做到细心、认真、专心、耐心。（5）注意学科之间的联系，密切联系过去所学的微生物学、药理学知识，微生物学密切相关。（6）掌握好生物检定统计有关的运算，并能运用统计学的知识分析、处理实验数据，误差原因，进行报告。教材及参考资料教材：理论教学采用高职教育的全国统编教材《药品生物检定技术》2007年版，李榆梅主编，化工出版社出版；实践教学采用自编教材。参考资料：⑴《中国药典》2010年版二部⑵《中国药品检验标准操作规范》2010年版⑶《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社有关规定1．课程性质：专业必修课。总课时为68，其中理论58课时，实践10课时，实验单列。2．考核方式：闭卷考试。3．成绩评定：⑴理论考核：平时作业、课堂讨论及小测验40%，期末考试60%。⑵实践考核：实践操作40%，实践结果与报告50%，实践纪律与预习10%。4．准备物品：作业本、计算器各一。第一章供试品溶液的配制第一节必备知识(55分)一、概况及任务（一）药品生物检定概念及特点1．概念2.生物检定的特点：3．有效性测定方法⑴对比检定概念⑵标准品概念、分类、要求及保存（二）生物检定适用范围（三）生物检定任务1.药品生物检定的主要任务2．药品生物检定的其他用途二、生物检定技术与相关学科的关系三、供试品（固体）溶液的配制（一）称量的操作要点及注意事项1．称量操作要点2．称量操作注意事项3．称量值计算（二）稀释的操作要点及注意事项1．稀释的操作要点2．稀释操作注意事项第二节实践操作(10分)一、操作目的（1）熟悉供试品的称量操作。（2）熟悉供试品的稀释操作。二、操作内容配制4u／ml及1u／ml的青霉素钾溶液。三、设备、仪器及器皿:见书P4四、供试品及试剂五、配制前准备六、操作步骤本节小结：（5分钟）1．药品生物检定技术的概念和任务。2．供试品（固体）溶液的配制。作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析加入课程简介使学生对课程有了整体了解，如实践操作配以教学录像效果会更好。

《药品生物检定技术》教案第2次课２学时章节第二章双碟的制备第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1．掌握培养基的制备方法。2．掌握双碟的制备方法。3．熟悉实践操作。教学重点难点【重点】1．培养基的制备方法。2．双碟的制备方法。【难点】双碟的制备方法。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】第一节必备知识一、培养基的制备(20分)1.制备方法：（1）配方（2）制法2.注意事项：（1）选择适当的原材料。由于胨、肉膏、酵母膏等原材料的性质对抑菌圈的清晰度及试验结果的精确度影响很大，因此，要通过预先试验，挑选适当品牌的材料使用。（2）不同品牌琼脂的用量不同，要通过预备试验定出具体数值。（3）培养基中的葡萄糖或其他糖类要在其他成分都配制好，琼脂熔化后加入（4）制成的培养基凝固后应透明，不得有沉淀。如产生沉淀，配制好后，趁热过滤后调PH，再分装消毒。（5）调PH宜为一次性，避免反复加酸、碱影响培养基质量。（6）制备好的培养基，使用期限为1个月，并贮存在冰箱中。分装培养基的容器应预先高压蒸汽灭菌30min。二、双碟的制备方法(50分)在抗生素效价测定中，装有培养基和试验菌的玻璃培养皿称为双碟。双碟中的培养基一般分底层（不含菌）和菌层。1．底层平板培养基的制备（倒底层）（1）用水平仪调整效价测定操作台面水平。（2）将培养皿置烤箱中160℃消毒2h后取出，移入无菌操作室内效价测定操作台面上，单个摆开。（3）用100℃水浴（微波炉）使培养基熔化后，在室温冷却至70℃左右，并仔细检查琼脂培养基是否熔化均匀，有无凝块。（4）用大口的灭菌刻度吸管，迅速吸取20ml培养基，注入各个培养皿内，均匀摊布，待其凝固后，盖上干燥的陶瓦圆盖，放置于35~37℃培养箱中保温。2．菌层平板培养基的制备（倒菌层）（1）从冰箱中取出菌液，回温至室温。（2）100℃水浴加热熔化培养基，冷却到一定温度（水浴温度，细菌为48~50℃，芽胞可至60℃）后，加入一定量菌液[预测试验而定（）法高剂量半径18~22mm；（）法中心浓度半径15~18mm]立即充分旋转摇匀，不得摇出气泡。（3）立即用灭菌的大口刻度吸管吸取含菌培养基5ml注入，均匀摊布在底层培养基上，盖上干燥陶瓦圆盖，（放置20~30分钟），待凝固。3．注意事项（1）玻璃双碟一定要干燥，不能有冷凝水。（2）刻度吸管要用砂轮割尖嘴，变成大口后用，否则易发生堵塞。（3）冬季室温较低，倒好底层的双碟，待凝固后，可先放入37℃恒温箱内温热，这样倒菌层时，培养基易于摊布水平。（4）摇匀菌层培养基时，一定注意不能摇出气泡。（5）无论是倒底层还是倒菌层动作快，尤其是倒菌层时要更加快。第二节实践操作(10分)一、操作目的：学习双碟的制备。二、设备、仪器、器皿及试剂：1．设备、仪器无菌室、恒温培养箱（室）、恒温水浴箱、烤箱、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、水平仪。2．器皿生物检定用培养皿、大口刻度吸管（20ml、10ml）、1ml小口刻度吸管、小锥形瓶（内装玻璃珠）、试管、锥形瓶。玻璃器皿均于160℃干热灭菌2h。3．试剂生物检定培养基Ⅱ号、金黄色葡萄球菌菌液。金黄色葡萄球菌菌液装于装有玻璃珠的小锥形瓶内，培养基于115℃高压蒸汽灭菌。三、制备前的准备（1）无菌室开启紫外灯至少30min。（2）用水平仪校正测定操作平台水平。（3）将已灭菌的生物检定用培养皿及吸管移至无菌室内。（4）将培养皿单个摆开。（5）从冰箱中拿出菌液，回温至室温，旋转摇15min。（6）将培养基（生测培养基）放在100℃水浴中熔化。（或微波炉内）（7）从熔化好的培养基中倒出100ml于另一消毒过的小锥形瓶内，于48℃保温。四、操作步骤1．倒底层2．倒菌层五、注意事项本节小结：（10分钟）双碟的制备步骤、注意事项作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析

《药品生物检定技术》教案第3次课２学时章节第三章无菌检查第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1．掌握药品的卫生学检查的内容。2．熟悉药品的卫生标准。3．熟悉无菌检查的范围。4．掌握无菌检查法。教学重点难点【重点】1．无菌检查法及SOP。【难点】SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、图片【教学内容】第一节必备知识（55分钟）一、药品卫生学检查药品的卫生学检查包括：无菌检查染菌量（细菌、霉菌、酵母菌总数）的检查控制菌（大肠杆菌、沙门杆菌、绿脓杆菌、破伤风杆菌、金黄色葡萄球菌）检查螨类检查二、药品卫生标准无菌检查：无菌微生物限度检查：不同剂型要求不同控制菌：不得检出螨类检查：不得检出三、需要进行无菌检查的范围⑴各种注射剂⑵眼用及外伤用制剂⑶植入剂⑷可吸收的止血剂⑸外科用敷料、器材第二节实践操作（25分钟）一、无菌检查法概念：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。二、常用的无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。薄膜过滤法适合于有抗菌作用或大容量的供试品。直接接种法适合于非抗菌作用的供试品。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。本节小结：（10分钟）1．药品的卫生学检查包括2．需要进行无菌检查的范围3．无菌检查法概念4．常用的无菌检查法作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析

《药品生物检定技术》教案第4次课２学时章节第三章无菌检查第二节实践操作教学目的和要求1．掌握药品的卫生学检查的内容。2．熟悉药品的卫生标准。3．熟悉无菌检查的范围。4．掌握无菌检查法。教学重点难点【重点】1．无菌检查法及SOP。【难点】SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、图片【教学内容】三、无菌检查法具体方法（80分钟）2010版药典无菌检查法方法验证及操作要点：见《中国药典》（2010年版二部）附录P89~931前言1.1定义1.2实验环境条件要求2.培养基2.1培养基的灭菌配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。2.2培养基的保存制备好的培养基应保存在2～25℃、避光环境。若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内使用。2.3培养温度硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。改良马丁培养基置23～28℃培养。2.4培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。无菌性检查每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。灵敏度检查金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基（12ml、9支其中1支空白）中30～35℃培养3天，逐日观察。白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基（9ml、5支其中1支空白）中23～28℃培养5天，逐日观察。结果判断：空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。3.稀释液、冲洗液及其制备方法4.方法验证试验目的：1)证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查2)确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。3)确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。4.1菌种菌种的复活菌液制备(一般当日使用)菌液的稀释菌液的菌数确认4.3薄膜过滤法验证实验将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入试验菌（小于100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照。将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证4.4直接接种法验证实验取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入规定量的供试品，另1管作为阳性对照，按规定的温度培养3～5天。4.5结果判断（验证实验）与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用：1)增加冲洗量2)增加培养基的用量3)使用中和剂4)更换滤膜品种消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。本节小结：（10分钟）1．培养基的保存2．培养温度3．培养基的适用性检查4．薄膜过滤法验证实验5．直接接种法验证实验作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析

《药品生物检定技术》教案第5次课２学时章节第三章无菌检查第二节实践操作教学目的和要求1．掌握药品的卫生学检查的内容。2．熟悉药品的卫生标准。3．熟悉无菌检查的范围。4．掌握无菌检查法。教学重点难点【重点】1．无菌检查法及SOP。【难点】SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、图片【教学内容】5.供试品的无菌检查5.1无菌检查法（5分）包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。5.2检验数量与检验量（10分）检验数量：指一次试验所用T最小包装的数量。抗生素类药与非抗生素类药品的最少检验量是相同的。表1、表2、表3中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量，也不包括验证试验用量。若采用薄膜过滤法，应增加1／2的最小检验数量作阳性对照用。只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。若采用直接接种法，应增加供试品1支(或瓶)作阳性对照用。检验量：指一次试验所用T的总量（g或ml)。每份培养基接种供试品的量按表2、表3规定。表3上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量5.3阳性对照和阴性对照（5分）阳性对照（＋）根据供试品特性选择阳性对照菌（小于100cfu），48～72h应生长良好。无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌的T---金黄色葡萄球菌抗革兰氏阴性菌的T---大肠埃希菌抗厌氧的T---生孢梭菌抗真菌的T---白色念珠菌阴性对照（－）相应溶剂和稀释液同法操作不得有菌生长5.4供试品处理及接种培养基（35分）薄膜过滤法薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，且总冲洗量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。水溶液供试品可溶于水的固体制剂供试品β-内酰胺类抗生素供试品非水溶性制剂供试品可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品无菌气（喷）雾剂供试品具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品混悬液等非澄清水溶液供试品β-内酰胺类或磺胺类供试品敷料供试品灭菌医用器具供试品5.5培养及观察（10分）硫乙醇酸盐流体培养基于30～35℃；改良马丁培养基的于23～28℃。均培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。5.6结果判断（10分）培养期结束后，阳性对照管显浑浊但经确证有菌生长，阴性对照管澄清，才可根据结果判断。符合规定供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。不符合规定供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。试验结果无效（即生长的微生物非供试品所含）当符合下列至少一个条件(1)无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；(2)回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；(3)阴性对照管有菌生长；(4)供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。四、报告书写（10分）本节小结：（5分钟）1．阳性对照和阴性对照2．供试品处理及接种培养基3．培养及观察4．结果判断作业1．药品的卫生学检查包括几方面？2．无菌检查法概念？3．常用的无菌检查法及适用范围?4．主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第6次课２学时章节第四章药品的微生物限度检查法第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1．熟悉微生物总数检查的概述。2．掌握微生物总数检查的注意要点。3．熟悉药品微生物限度标准。4．掌握微生物的总数检查。教学重点难点【重点】１．微生物总数检查的注意要点。２．微生物的总数检查及SOP。【难点】微生物的总数检查及SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】第一节必备知识（20分）微生物限度检查法定义：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括：细菌、霉菌、酵母菌计数及控制菌检查。实验环境条件要求：在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。培养温度：常用的微生物限度检查法：平皿法、薄膜过滤法。第二节实践操作（05版药典微生物限度检查法）一、检验量（10分）检验量：即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；化学膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。二、供试液的制备（50分）1．液体供试品取供试品10ml，加无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。2．固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g，加无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为l:10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。3．需用特殊供试液制备方法的供试品（1）非水溶性供试品方法1取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20的供试液。方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录ⅩⅡH无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1:10的供试液。（2）膜剂供试品取供试品100cm2，剪碎，加无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100ml（必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1:10的供试液。（3）肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1:10（4）气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。（5）具抑菌活性的供试品当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。②离心沉淀集菌法取一定量的供试液，3000转／分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转／分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，取底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。③薄膜过滤法见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。本节小结：（10分钟）1．微生物限度检查法定义2．检查项目包括3．常用的微生物限度检查法4．检验量5．供试液的制备作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第7次课２学时章节第四章药品的微生物限度检查法第二节实践操作教学目的和要求1．熟悉微生物总数检查的概述。2．掌握微生物总数检查的注意要点。3．熟悉药品微生物限度标准。4．掌握微生物的总数检查。教学重点难点【重点】１．微生物总数检查的注意要点。２．微生物的总数检查及SOP。【难点】微生物的总数检查及SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】三、细菌、霉菌及酵母菌计数（一）计数方法的验证（15分钟）验证的目的：确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。就是要对每个样品使用适宜的检验方法，顺利的检出样品中污染的各种类型的菌。验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。菌株选择的原则：代表性,普遍性,低或非致病性,标准菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。菌液制备：50～100cfu/ml。1、计数验证用菌种2、菌液的制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18~24小时。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24~48小时。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5~7天。上述培养物用％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。3、验证方法（30分钟）所有验证方法的操作均应在阳性接种间。验证方法包括：细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证、控制菌检查方法的验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌株每次试验的回收率。（1）试验组平皿法计数时：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100CFU试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。（2）菌液组测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。（4）稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每lml供试液含50～100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。4、结果判断（10分钟）在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于70%。试验组的菌回收率应均不低于70%。照该供试液制备方法和计数法测定供试品细菌、霉菌及酵母菌数。若任一次试验组的菌回收率低于70%，应采取培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除抑菌成分，并重新验证。（二）供试品检查法计数方法包括平皿法和薄膜过滤法检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。1．平皿法（5分钟）常规法和培养基稀释法都是平皿法。供试液通过离心沉淀以后也可用平皿法检查。采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。阴性对照试验取试验用的稀释液1ml置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板（共4个平板），均不得有菌生长。培养与计数在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂：用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。平皿法菌数报告规则2．薄膜过滤法（20分钟）滤膜孔径应不大于μm，直径一般为50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。阴性对照试验：取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。薄膜过滤法菌数报告规则（三）结果判断（10分钟）供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。（四）报告书写（5分钟）本节小结：（5分钟）1．供试品检查法2．结果判断作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第8次课２学时章节第五章控制菌及螨类检查第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1.掌握大肠埃希菌的检查。2.熟悉控制菌检查的意义。教学重点难点【重点】１．大肠埃希菌的检查及过程。【难点】1．控制菌检查的方法教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】一、控制菌检查药典收载的控制菌：大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌。（一）控制菌检查方法的验证（20分钟）1、控制菌试验菌株：2、菌液制备用0.9%无菌氯化钠溶液制每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。3、验证方法(1）试验组（2）阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组。（3）验证结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。（二）供试品检查法（60分钟）供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。1、阳性对照试验2、阴性对照试验3、控制菌检查基本程序：供试液制备→增菌培养→选择性培养基（分离）培养→挑取疑似菌落（纯培养）→生化试验→报告结果控制菌检查：⑴大肠埃希菌①检验程序②供试液制备③BL增菌培养取供试液10ml(相当于供试品1g，1ml，10cm2)，直接或处理后接种至适量的(不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18-24小时，必要时可延长至48小时。④检查大肠埃希菌取上述培养物，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性;呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。⑤大肠埃希菌结果判断⑥结果报告当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性。供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌;MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。MUG阳性、靛基质阴性。IMViC试验为一十一一、革兰阴性杆菌，报告1g或lml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为十十一一、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。不符合③④报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。⑵大肠菌群的检查只对中成药制剂：含原药材粉未、豆豉、神曲的中药口服制剂必需检。大肠菌群的检查程序：供试品→供试液→胆盐乳糖发酵培养基→产酸产气→EMB或MACL（分离）培养→乳糖发酵培养基→产酸产气→报告结果。本节小结：（10分钟）大肠埃希菌：①检验程序②结果报告作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第9次课２学时章节第五章控制菌及螨类检查第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求沙门菌和、铜绿假单胞菌的检查。控制菌检查的意义。教学重点难点【重点】１．大肠埃希菌的检查及过程。【难点】1．控制菌检查的方法教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】一、控制菌检查药典收载的控制菌：沙门菌、铜绿假单胞菌。（一）控制菌检查方法的验证（20分钟）1、控制菌试验菌株：2、菌液制备用0.9%无菌氯化钠溶液制每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。3、验证方法(1）试验组（2）阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组。（3）验证结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。（二）供试品检查法（60分钟）供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。1、阳性对照试验2、阴性对照试验3、控制菌检查(1)沙门菌检验程序：供试品→供试液→营养肉汤(37℃，18-24h)→四硫磺酸盐增菌液(37℃，18-24h)→分离培养，DHL琼脂(或SS琼脂平板)或EMB琼脂平板(或麦康凯琼脂平板)(37℃，24h-48h)→初步确定试验，TSI琼脂斜面(37℃，18-24h)→生化反应（氰化钾试验赖氨酸脱羧试验靛基质试验尿素酶试验等）→血清学试验（2）铜绿假单胞菌检验程序：供试液的制备→增菌培养(胆盐乳糖培养基BL中)→分离培养(溴代十六烷基三甲铵培养基)→纯培养(营养琼脂斜面)→染色镜检(G-无芽胞杆菌)→生化试验(氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验、明胶液化试验)→结果报告①革兰阴性杆菌，氧化酶试验十，绿脓菌素试验十，报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。②革兰阴性杆菌，氧化酶试验十，绿脓菌素试验为一，硝酸盐还原产气试验十，42℃生长试验十，明胶液化试验十，报告1g或1ml与①②不符报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。本节小结：（10分钟）1．沙门菌：①检验程序②结果报告2．铜绿假单胞菌：①检验程序②结果报告作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第10次课２学时章节第五章控制菌及螨类检查第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求金黄色葡萄球菌、梭菌的检查。控制菌检查的意义。教学重点难点【重点】１．大肠埃希菌的检查及过程。【难点】1．控制菌检查的方法教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】一、控制菌检查药典收载的控制菌：金黄色葡萄球菌、梭菌。（一）控制菌检查方法的验证（20分钟）1、控制菌试验菌株：2、菌液制备用0.9%无菌氯化钠溶液制每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。3、验证方法(1）试验组（2）阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组。（3）验证结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。（二）供试品检查法（60分钟）供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。1、阳性对照试验2、阴性对照试验3、控制菌检查基本程序：供试液制备→增菌培养→选择性培养基（分离）培养→挑取疑似菌落（纯培养）→生化试验→报告结果控制菌检查：（1）金黄色葡萄球菌检验程序：供试品→供试液10ml→亚碲酸钠肉汤或营养肉汤100ml增菌培养→卵黄高盐琼脂平板或甘露醇高盐琼脂培养基分离培养（含有高盐作用是抑制革兰氏阴性短杆菌生长，但不影响金黄色葡萄球菌正常生长）→普通肉汤琼脂斜面纯培养→革兰染色镜检→血浆凝固酶试验→结果报告。（2）梭菌的检查1.样品的前处理2.增菌培养3.分离4.染色、过氧化氢酶试验本节小结：（10分钟）1．金黄色葡萄球菌：①检验程序②结果报告2．梭菌：①检验程序②结果报告作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第11次课２学时章节第五章控制菌及螨类检查第二节实践操作教学目的和要求1.掌握螨类的检查。教学重点难点【重点】１．螨类的检查及SOP。【难点】1．控制菌检查的方法2．螨类检查的方法教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、图片【教学内容】二、螨类检查（5分钟）螨的体形微小，多在lnm以下。一般呈卵形或椭圆形，无头、胸、腹界限。幼螨足三对，若螨足四对，成螨足多数为四对。足通常由六节组成。口器向前端突出，螯肢常呈螯钳状，有齿，由2～3节组成。须肢节数因种类而异，由1～2节到5节组成。有些种类在躯体前端或两侧有1～2对眼。躯体两侧对称，表面被有坚硬的几丁质的板。体表有刚毛，它的形状、数目及彼此间长短比例和排列位置因种类而异。活螨多为略带白色，晶亮的囊状小体。螨类与蜘蛛、昆虫（如书虱）相比，其外形比较近似，因此，必须注意它们之间的主要区别。（一）活螨的检查方法（20分钟）一般分为直检法、漂浮法和分离法三种。1、直检法：使用器具、方法2、漂浮法：使用器具、方法3、分离法：使用器具、方法小结：在上述三种方法中，第l、2法简单易行，而且效果好，检出率高，比较常用。而第3种方法，较费时，效率低，一般较少采用。（二）各种剂型药品的活螨检查（30分钟）供试品取样量，一般供试品每批抽检两瓶。以单剂量、一日剂量包装的样品，每批抽取两盒（每盒检查3～4个最小包装单位）；贵重或微量包装的供试品，取样量可酌减。必要时，可再次抽样，或选取有疑问的样品进行检查。大蜜丸小蜜丸、水丸有虫粉现象的丸、片散剂、冲剂和胶囊剂等块状冲剂液体制剂及半固体制剂（三）活螨卵的检验（20分钟）螨卵（如腐食酪螨卵）极小，一般在以下，呈乳白色，椭圆形或卵圆形。10－20倍放大镜或显微镜下方可查见。螨卵常见于活螨群的周围。一般在供试品中已经检出活螨的，不再进行活螨卵的检查。对可疑供试品，未检出活螨时，可注意检查活螨卵。检查活螨卵方法如下：（1）30％甘油溶液接种培养（2）大蜜丸接种培养法（四）检验结果报告在供试品中检出活螨时,作检出活螨报告。在供试品中未检出活螨,但检出活螨卵时,可按检出活螨处理。（五）保留阳性结果（10分钟）保留阳性结果备查，可将检出的活螨制成临时观察标本和长期保存标本。1．临时观察标本制作2．长期保存标本制作：本节小结：（5分钟）1．活螨的检查方法2．检验结果报告3．保留阳性结果作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第12次课２学时章节第六章抗生素效价的微生物测定第一节必备知识第二节抗生素的微生物测定教学目的和要求1．熟悉抗生素的效价和单位。2．熟悉抗生素效价单位的表示方法。3．掌握抗生素微生物检定法的种类。4．掌握管碟法的二剂量法。教学重点难点【重点】1．抗生素微生物检定法的种类。2．二剂量法及SOP。【难点】二剂量法及SOP教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学【教学内容】第一节必备知识（25分钟）一、抗生素定义二、抗生素的效价和单位抗生素的活性高低用效价和单位来表示。有时，效价和单位不加区别，统称为效价单位。抗生素的效价：是衡量抗生素中有效成分的效力的相对标准。是指供试品的实际单位数与其标示量的比值，经常表示为效价的百分数。抗生素的单位（U）：是衡量抗生素有效成分的效力的具体尺度。三、抗生素效价单位的表示方法1．质量单位2．类似质量单位3．质量折算单位4．特定单位第二节抗生素的微生物测定（60分钟）一、抗生素微生物检定法的概况（一）抗生素微生物检定法定义是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法。（二）微生物检定法的特点：二、抗生素微生物测定法分类1.比浊法定义:是利用抗生素在液体培养基中对实验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对实验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。实验设计：有标准曲线法、二剂量法及三剂量法三种试验设计。2.琼脂扩散法琼脂扩散法，亦称管碟法。定义:系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。实验设计：二剂量法及三剂量法二种试验设计。3.稀释法定义：系采用液体培养基将抗生素稀释成一系列浓度，并依次分装在各试管中，加入等量的试验菌液，经培养一定时间，观察哪种稀释浓度能抑制细菌生长，即作为测定终点。再与同种抗生素标准品经同样处理的终点做比较，求得供试品的效价。此法测定误差大，已不作为含量测定方法，适用于抗生素的最低抑菌浓度（MIC）测定。三、抗生素微生物测定法(一)抗生素微生物测定法方法比较(二)操作技术1.比浊法操作技术抗生素微生物检定浊度法试验设计表简要实验流程图操作技术：（1）准备工作（2）加样（3）加含菌培养基（4）阳性管制备与空白管（5）培养（6）检测（7）计算（8)报告生成本节小结：（5分钟）1．抗生素微生物检定法定义2．抗生素微生物测定法分类作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第13次课２学时章节第六章抗生素效价的微生物测定第二节抗生素的微生物测定教学目的和要求1．熟悉抗生素的效价和单位。2．熟悉抗生素效价单位的表示方法。3．掌握抗生素微生物检定法的种类。4．掌握管碟法的二剂量法。教学重点难点【重点】1．抗生素微生物检定法的种类。2．二剂量法及SOP。【难点】二剂量法及SOP教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、图片、录像【教学内容】2.琼脂扩散法（35分钟）（1）效价测定方法要求=1\*GB3①二剂量法=2\*GB3②三剂量法（2）琼脂扩散法操作技术=1\*GB3①准备工作=2\*GB3②菌液制备=3\*GB3③培养基制备=4\*GB3④供试液的制备=5\*GB3⑤双碟的制备=6\*GB3⑥放置小钢管(牛津杯)=7\*GB3⑦滴加药液=8\*GB3⑧培养=9\*GB3⑨测量（三）数据处理（25分钟）（1）将反应值或规定的函数（y）按剂量分组列成方阵表。（2）特异反应剔除和缺项补足。目的：运用统计方法来验证实验结果是否符合量反应的平行线设计原理，是否偏离了直线性和平行性，以便评价实验结果的可靠性。（l）可靠性测验的统计方法=1\*GB3①实验结果的方差分析=2\*GB3②剂间变异的分析（2）可靠性测验结果分析（3）可靠性测验结果判断（）法、（）法：回归、剂间应非常显著（P＜）、偏离平行应不显著（P＞）（）法、（3.3.3）法：回归、剂间应非常显著（P＜）、偏离平行应不显著（P＞）、二次曲线与反向二次曲线均应不显著（P＞）四、不同剂型药品的供试液配制（20分钟）1.原料药品2.制剂⑴注射用冻干粉末⑵水针剂⑶片剂①素片②糖衣片、肠衣片⑷胶囊剂⑸颗粒剂或干糖浆⑹软膏剂或眼膏剂：本节小结：（10分钟）1．琼脂扩散法实验流程2．实验数据处理作业主要参考资料⑴《中国药典》2010年版二部⑵《中国药品检验标准操作规范》2010年版⑶《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第14次课２学时章节第七章生物检定统计法与微机运算第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1．熟悉生物检定统计法的有关概念。2．掌握常用的生物检定统计法。3．掌握微机运算实践操作。教学重点难点【重点】１．常用的生物检定统计法。2．微机运算实践操作。【难点】微机运算实践操作教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学【教学内容】一、总则（25分钟）生物检定法是利用药物对生物体或其离体器官组织等所起的药理作用来检定药物效价的方法。用于无适当理化方法进行检定的药物。凡生物检定法测定效价的品种必须进行实验可靠性测验及可信限计算等。生物检定标准品供试品等反应剂量对比控制生物变异必须注意以下几点：误差项指从实验结果的总变异中分去不同剂量及不同因级对变异的影响后，剩余的变异成分，用方差（S2）表示。对于因实验设计类型的限制无法分离的变异成分，或估计某种因级对变异的影响小，可不予分离者，都并入S2。但剂间变异必须分离。可靠性测验（1）可靠性测验目的：通过适当的统计方法，验证实验结果是否符合量反应的平行线原理，是否偏离了直线性和平行性，从而评价实验的可靠程度。对于偏离不显著（在一定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立时，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。（2）可靠性测验方法：实验结果可靠性是以方差分析法测验的，测验多组均数之间的差别是否显著。在实验中存在着S和T的差别，直线及平行线的关系，剂量与双碟之间的关系。通过统计以上各组数之间方差，以试品间、回归、偏离平行、剂间（列）、碟间（行）的方差与误差项（S2）的比值（称F值），来确定各自的差异的显著性程度。可信限可信限（FL）标志检定结果的精密度。各品种的检定方法项下都有其可信限率的规定。对同批供试品重复试验所得n次实验结果（包括FL％超过规定的结果），可按实验结果的合并计算法算得PT的均值及其FL％作为检定结果。二、生物检定的常用方法（60分钟）质反应的直接测定法、平行线测定法。量反应的平行线测定法。（一）直接测定法直接测定法：直接测得药物对各个动物最小效量或最小致死量的检定方法。如洋地黄及其制剂的效价测定。xS和xT为S和T组各只动物的对数最小致死量，它们的均值xS和xT为S和T的等反应剂量，ns和nT为S和T组的动物数。1．效价计算2．误差项及可信限计算当两批以上供试品（T、U）和标准品同时比较时，按（9）式计算S、T、U的合并方差S2。效价PT、PU则是T、U分别与S比较，按（1）～（3）式计算。例1直接测定法的微机运算（软件运用）（二）量反应的平行线测定法量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者，称~，如血压、血糖的变化值。量反应平行线测定法要求：在一定剂量范围内，S和T的对数剂量X和反应或反应的特定函数Y呈直线关系，当S和T的活性组分基本相同时，两直线平行。1．实验设计类型（1）随机设计（2）随机区组设计生物检定品种的量反应检定主要有：（）法；（）法或（）法、（）法，即S，T（或U）各用2个剂量组或3个剂量组，统称（k．k）或（）法。一般都是按（）法实验设计。中国药典平行线测定法的计算都用简算法。简算法要求（）法实验设计必须符合以下条件：（1）S和T相邻高低剂量组的比值（r）要相等，一般r用～，lgr=I（2）各剂量组的反应个数（m）应相等。本节小结：（5分钟）1．直接测定法定义2．量反应定义作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第15次课２学时章节第七章生物检定统计法与微机运算第一节必备知识第二节实践操作教学目的和要求1.熟悉生物检定统计法的有关概念。2.掌握常用的生物检定统计法。3.掌握微机运算实践操作。教学重点难点【重点】1.常用的生物检定统计法。2.微机运算实践操作。【难点】微机运算实践操作教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学【教学内容】2．效价及误差计算（45分钟）效价及误差计算处理步骤如下：（1）将反应值或规定的函数（y）按剂量分组列成方阵表。（2）特异反应剔除和缺项补足①特异反应剔除（随机区组设计）②缺项补足缺项不得超过反应总个数的5％。练习1（）法随机区组设计特异剔除和缺项补足练习2（）法随机区组设计特异剔除和缺项补足（3）方差分析与可靠性测验。①可靠性测验采用F测验，即实验结果的方差分析。将实验结果求得的F值与查表F值比较若大于F（f1,f2）的F值，则P＜，表示差别有非常显著意义。若大于F（f1,f2）的F值，则P＜，表示差别有显著意义。若小于F（f1,f2）的F值，则P＞，表示差别无显著意义。②可靠性测验结果判断（）法、（）法：回归、剂间应非常显著（P＜）、偏离平行应不显著（P＞）（）法、（）法：回归、剂间应非常显著（P＜）、偏离平行应不显著（P＞）、二次曲线与反向二次曲线均应不显著（P＞）（4）进行效价及可信限计算（2．2）法的微机运算（软件运用）（三）实验结果的合并计算（40分钟）同一批供试品重复n次测定，所得n个测定结果，可用合并计算的方法求其效价PT的均值及其FL。参加合并计算的n个结果应该是：（1）各个实验结果是独立的，完整的，是在动物来源、实验条件相同的情况下，与标准品同时比较所得的检定结果(PT）。（2）各次检定结果，经用标示量或估计效价（AT）校正后，取其对数值（lgPT）参加合并计算。计算时，令lgPT=Mn次实验结果共n个M值，按（35）式进行χ2测验当χ2计算小于χ2（f）查表值时，认为n个实验结果均一，可按（37）式、（38）式、（39）式计算n个M的加权均值M、SM及其FL。合并计算的自由度（f）是n个实验结果的S2自由度之和。，按此f查t值表（表一）得t值。PT及其可信限按（40）式、（41）式计算：FL％按（8）式计算。当χ2计算值大于χ2（f）查表值时，则n个实验结果不均一，可用以下方法进行合并计算。（1）如为个别实验结果影响n次实验结果的均一性，可以剔除个别结果，将其余均一的结果按以上公式进行合并计算。（2）如果n次实验结果的不均一性并非个别实验结果的影响，则按（42）式、（43）式计算n个M的不加权均值M及其SM，再按（39）式、（40）式、（41）式计算M的FL、PT及其FL。如洋地黄及其制剂的效价测定。实验结果合并计算的微机运算（软件运用）本节小结：（5分钟）1．效价及误差计算的处理步骤2．可靠性测验结果判断作业1．简算法要求（）法实验设计必须符合的条件2．效价及误差计算的处理步骤3．可靠性测验结果判断主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第16次课２学时章节第八章毒力及异常毒性检查第一节必备知识第二节异常毒性检查法教学目的和要求1．熟悉药品的有害物质检查。2．熟悉限度实验。3．熟悉葡萄糖酸锑钠。4．熟悉异常毒性检查法的概念。5．掌握药品的异常毒性试验概念。6．掌握药品异常毒性试验试剂剂量确定方法。7．掌握异常毒性检查法。8．掌握葡萄糖酸锑钠毒力检查法。教学重点难点【重点】１．药品的异常毒性试验概念。2．药品异常毒性试验试剂剂量确定方法。3．异常毒性检查法及SOP。【难点】异常毒性检查法及SOP教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、录像【教学内容】第一节必备知识一、相关知识（5分钟）1、药物杂质来源：一是生产制备中产生，二是贮藏过程中产生。2、杂质检查实质：限度实验。该测试物并不一定要定量测出其准确值，只是确定其是否超过限度。主要适用于药物的毒性成分及有害物质的检测。3、药品的有毒杂质及有害杂质检查应用：有毒杂质检查：一种新药或一种新制剂，以及一些毒性较大的药品和生化制品，在临床使用前；有害杂质检查：在生产、贮藏过程中对有害杂质作追踪考察，及时采取措施预防或去除。二、毒性试验（5分钟）毒性试验分为：一般毒性试验和特殊毒性试验。此外，还有依赖性试验、过敏试验和局部刺激试验等。一般毒性试验包括急性毒性试验、长期毒性试验。特殊毒性试验包括致突变试验、致癌试验、致畸试验。药品的异常毒性试验：是用稳定剂量按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以试验动物死亡与否为终点，这实际上是一个限度试验。在此剂量下，一般供试品不应使动物中毒致死；如果出现实验动物急性中毒而死亡，则反映该供试品中含有的急性毒性物质超过了正常水平。本试验又称为异常毒性检查法三、药品异常毒性试验试剂剂量确定方法（30分钟）1．给药途径：可根据药物的性质、使用方法等加以选择。2．给药剂量：可根据临床人用剂量乘以一定的安全系数，然后再折算成小鼠体重的剂量。安全系数的确定：一般治疗性药品的安全系数可定为50～100，长期服用药品的安全系数可定为100以上。亦可用实验方法求出：例：某药品的剂量为4ml，当剂量为（以％氯化钠注射液稀释至），给小鼠静脉注射时引起死亡，减剂量再试，在／20g没有引起死亡，则该药品的安全系数为：安全系数×60000／（4×20）=120小鼠给药剂量的确定：例：某注射剂，成人每次注射剂量为4ml，安全系数为50，则小鼠的给药剂量为：小鼠剂量=4×20×50／取该药品加入％氯化钠注射液稀释成作为供试品的注射用量。练习：P147—2、3第二节异常毒性检查法（30分钟）一、概念本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或口服给药，在规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定的一种方法。二、供试用的小鼠健康合格，体重17～20g，在试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。作过本试验的小鼠不得重复使用。三、检查法除另有规定外，取上述小鼠5只，按各品种项下规定的给药途径，每只小鼠分别给予供试品溶液。给药途径分为以下几种：静脉注射、腹腔注射、皮下注射、口服给药1．静脉注射2．腹腔注射3．皮下注射4．口服给药四、异常毒性检查法结果判断符合规定：⑴初试：除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡；⑵复试：如有死亡时，应另取体重18～19g的小鼠10只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。不符合规定：初试、复试均有死亡。五、异常毒性试验记录练习第三节葡萄糖酸锑钠毒力检查法（15分钟）一、概念系比较葡萄糖酸锑钠标准品与供试品引致小白鼠死亡的数量，以判断供试品毒力是否符合规定。二、实验材料及用具（5分钟）三、溶液配制1．标准品溶液实验当日，取标准品放置至室温。割开标准品管（注意勿使玻屑掉入），精密称取一定量。加适量温水，加热（约70℃，15分钟）搅拌，使全部溶解，放冷至室温。补足水至一定量，密塞并充分摇匀。于50℃恒温条件下加温30分钟,放冷至室温。(二次加热使其毒性稳定)按（体重）尾静脉注入。死亡率20%~80%为合适浓度。一般溶液浓度约为40~60mg（SbV）标准品溶液浓度按干燥品含锑量计算。例S的水分14.24%，含锑量（干燥品）为32.83%，称S时，计算含锑量，以此值计算配成适当浓度。溶液配制练习含锑量为：×（）×0.3283=2．供试品溶液⑴粉末：配制方法与标准品同，但其浓度为标准品的83％。⑵注射液：按标示量用水稀释，浓度为标准品的83％。配制方法与标准品同。四、实验动物健康无伤，体重17～25g的小鼠40或20只，每次实验各鼠间体重相差不超过3g。实验当日将小鼠均匀分成两组。五、检查法（5分钟）给两组小鼠分别按体重（）自尾静脉注入标准品或供试品溶液，注射速度应均匀，每只在4～5秒内注完。给药后立即观察15分钟，记录小鼠死亡数。六、结果判断⑴用40只小鼠检查时符合规定：供试品组的小鼠死亡数较标准品组小鼠死亡数少或两组小鼠死亡数相同，即可认为供试品的毒力符合规定。（T≤S）不符合规定：供试品组的小鼠死亡数较标准品组小鼠死亡数多，则认为供试品的毒力不符合规定。⑵用20只小鼠检查时符合规定：供试品组小鼠死亡数比标准品组少2只或2只以上，可认为供试品的毒力符合规定。（T比S少≥2）不符合规定：供试品组小鼠死亡数比标准品组多2只或2只以上，即可认为供试品的毒力不符合规定。（T比S多≥2）重新试验（用20只小鼠检查时）：两组小鼠死亡数相同或仅相差1只，须另取小鼠20只重新试验。将前后两次试验结果合并计算，按上述用40只小鼠的判断方法处理结果。本节小结：（5分钟）1．异常毒性检查法概念2．给药途径3．结果判断作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第17次课２学时章节第九章热原及细菌内毒素检查第一节必备知识第二节热原检查法教学目的和要求1．熟悉热原的来源。2．熟悉热原的化学性质。3．熟悉热原的常用检查法。4．掌握家兔升温法。5．掌握细菌内毒素检查法。教学重点难点【重点】1．家兔升温法及SOP。2．细菌内毒素及SOP。【难点】家兔升温法及SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学、图片【教学内容】第一节必备知识（15分钟）一、热原的来源热原普遍存在于天然水、自来水及其他不清洁水中，有些药物及器皿也会污染有热原，特别是葡萄糖、乳酸钠、氯化钠、水解蛋白、枸橼酸钠、血液制品、右旋糖酐等生物制品、生化制品及适于细菌生长的药品。二、热原的化学性质药物中的热原主要是细菌的内毒素1.耐热性：100℃时不分解，120℃，4h破坏98％，180℃、2h以上或2502.滤过性:≤μm，能通过滤菌器，但不能通过半透膜及石棉板。3.溶解性:能溶于水，本身不挥发，但能随水蒸汽雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染；故蒸馏器需有隔沫装置。4．稳定性:可被强酸、强碱和氧化剂破坏5．抗原性:多糖体部分具有抗原性。反复接触热原，生物体会产生耐受性。三、常用消除热原的方法1．吸附法:活性炭用量为％～％，加热到70℃2．蒸馏法:热原不挥发，适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。在制备蒸馏水时，蒸馏器中应有隔沫板。3．热破坏法:适于高温处理的，可用180℃干烤2h，或250℃干烤4．滤过法:可用石棉板滤器去除滤液中的热原。5．强酸强碱处理法:注射液的包装容器可用强酸等浸泡。四、常用的热原检查法家兔法、细菌内毒素法第二节药品的热原检查法（50分钟）《中国药典》二部热原检查方法是采用家兔升温法进行检查。家兔法定义：本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。一、供试验用家兔（1）应健康，雌者无孕，体重～。（2）测温前至少7日应用同一饲料喂养。在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常。（3）未曾用于热原检查的家兔（4）用于热原检查后的家兔二、试验前准备（1）试验用的注射器、针头及一切与供试液接触的器皿，洗净后应置干烤箱250℃加热30min，或其他适宜方法。（2）测温探头的精确度应为±℃。每只家兔注射前、后应使用同一支测温探头。（3）热原质检查前1～2日，供试验用家兔尽可能处于同一温度环境中。实验室和饲养室温度相差不得超过5℃，实验室温度保持在17～25℃。试验的全过程中室温变化不得大于3℃，并应保持安静，避免强光照射和噪音干扰。三、检查法（1）每批供试品初试用3只，复试用5只家兔。（2）试验前家兔应禁食1h以上，置适宜装置中，至完毕。测量正常体温，共测两次，间隔30min，两次温差不得大于℃，以此两次体温的平均值为该兔的正常体温。当日使用家兔体温应在℃，同组兔间正常体温之差不得大于℃。供试品注射的体积，按家兔体重每kg不小于，不大于10ml。（3）测家兔正常体温后15min内，按规定剂量自耳静脉缓缓注入预热至38℃的供试品，每隔30min测量体温1次，连测6次。四、结果判断符合规定①在初试的3只家兔中体温升高均＜℃，并且3只家兔体温升高总和＜℃；②在复试的5只家兔中体温升高≥℃的家兔不超过l只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为≤℃。不符合规定①在初试3只家兔中体温升高≥℃的家兔超过1只；②在复试的5只家兔中体温升高≥℃的家兔超过1只；③在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和＞℃。当家兔升温为负值时，均以0℃计。复试①判定标准（在初试3只家兔中）体温升高≥℃的家兔有1只。或体温升高均＜℃，但3只家兔体温升高总和≥℃。②对家兔的要求（三点）：家兔体重；体温℃；次数使用2~3次。热原检查记录练习（20分钟）第三节细菌内毒素检查法（25分钟）一、定义：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。二、常用的细菌内毒素检查法凝胶法和光度测定法。光度测定法又包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。三、细菌内毒素的量：用内毒素的单位EU表示。四、原理鲎细胞中含有一种凝固酶原和一种凝固蛋白原。其凝固酶原被内毒素激活而成具有活性的凝固酶，使凝固蛋白原转变成凝固蛋白而形成凝胶。鲎试验法能检测出微克的内毒素，而家兔法只能检测出微克的内毒素。鲎试验对革兰阴性菌以外的内毒素不够灵敏，不能替代家兔法。五、凝胶法操作方法1．鲎试剂灵敏度复核（1）细菌内毒素标准溶液的制备：BET水溶解封口混15分→稀释成4个浓度，每步均混30秒。（2）待复核鲎试剂的制备：18支支鲎试剂加水溶解轻混。（3）加样18支排5列。4列4支分加λ、λ、λ和λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入检查用水。（4）封口恒温：加样后封口轻混→水平保温60分。（5）观察并记录结果：取出缓倒180o观察。（6）结果计算:鲎试剂灵敏度测定值：λc=lg－1（ΣX/4）（7）结果判断：当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度λ管均为阴性,阴性对照管为阴性，实验为有效。当λ≤λc≤2λ时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。举例设待复核鲎试剂的灵敏度为／ml。实验结果如下：（15分钟）2．干扰实验（1）干扰实验预实验使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。每一稀释倍数下做2支T管和2支T阳性对照（即2λ浓度）。另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。例：设某注射液限值为／ml，按MVD=CL／λ计算出灵敏度为／ml下的MVD为80倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用灵敏度为／ml的鲎试剂进行预实验。结果如下如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。本节小结：（5分钟）1．细菌内毒素检查法定义2．凝胶法操作方法3．鲎试剂灵敏度复核步骤及结果判断作业主要参考资料1．《中国药典》2010年版二部2．《中国药品检验标准操作规范》2010年版3．《生物药物分析》2002年版白秀峰主编中国医药科技出版社课后自我总结分析《药品生物检定技术》教案第18次课２学时章节第九章热原及细菌内毒素检查第三节细菌内毒素检查法（鲎试剂法）教学目的和要求1．熟悉热原的来源。2．熟悉热原的化学性质。3．熟悉热原的常用检查法。4．掌握家兔升温法。5．掌握细菌内毒素检查法。教学重点难点【重点】1．家兔升温法及SOP。2．细菌内毒素及SOP。【难点】细菌内毒素及SOP。教学过程【教学方法】讲授法、提问法、练习法【辅助手段】多媒体教学【教学内容】（2）正式干扰实验（10分钟）①制备内毒素标准对照溶液：用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、λ、λ。②制备含内毒素的供试品溶液：将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度2λ、λ、λ、λ的内毒素的供试品溶液。③鲎试剂的准备：取规格为／支的鲎试剂36支，每支加入检查用水溶解，轻混使溶。④加样：将准备好的鲎试剂取其中