逆境胁迫对植物生理生化指标的影响

本科学生综合性实验报告学号姓名学院专业、班级实验课程名称植物生理学实验教师及职称开课学期2012至2013学年上学期填报时间2012年12月15日云南师范大学教务处编印逆境胁迫对植物生理生化指标的影响摘要：对植物产生危害的环境称为逆境，又称胁迫。干旱是制约植物生长的主要逆境因素，以小麦幼苗在模拟干旱胁迫下，植株体内的生理生化指标会发生变化。实验采用PEG处理小麦幼苗，对抗氧化酶；脯氨酸；谷胱甘肽；过氧化氢；可溶性糖；丙二醛在植物体内的含量变化进行了研究，实验通过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量，而通过对正常条件下的和逆境胁迫下一定量小麦体内以上各种物质含量的对比，从而了解小麦体内生理生化指标发生的变化。关键词：小麦（TriticumaestivumLinn）；干旱胁迫；生理生化1引言干旱是自然界常见的逆境胁迫因素，而且干旱也是植物最容易受到的胁迫之一。干旱不仅制约植物的生长发育与产量，也会引起植被结构与功能的时空变化。因此植物对干旱胁迫的适应及机制一直是植物逆境适应策略研究的一个热点【1-3】作物抗旱性的研究方法有多种，适应能力进行了研究：植物对干旱胁迫的适应过程和受伤害程度与干旱胁迫的强度以及植物自身的抗性紧密联系，并从生化代谢、生理功能、形态适应、生长发育以及生物生产力等多种形式表现出来【1-5】。土壤有效水分状况与植物之间的关系一直是植物生理生态学研究领域的热点问题。大多数植物在短期或轻度土壤缺水情况下叶片水势下降，气孔关闭。限制CO2摄取和光合作用速率：长期严重干旱条件下可限制植物生长,引起形态结构发生变化。甚至导致植物死亡【6】。大多实验是在人工控制的干旱或人工模拟干旱条件下进行。其主要方法是室外盆栽控制水分，苗期室内水培或砂培采用PEG渗透胁迫、人工控制的温室、气候室和培养箱等。其中，PEG渗透胁迫法简单易行、条件容易控制、重复性好、试验周期短。本试验采PEG溶液模拟干旱胁迫的方法，研究干旱胁迫对小麦幼苗发芽率、抗氧化酶、脯氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、可溶性糖、丙二醛等生理生化指标含量的变化，并初步探讨小麦的抗逆机理，期望能够应用于农业生产实践中，为干旱农业生产提供理论依据。ml→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。POD测定：取POD反应混合液（10mol/L愈创木酚，5mol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ul（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应1min时的A470。PPO测定：取PPO反应混合液（20mol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应1min时的A410。计算：以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：PODactivities=PODactivities=(mol.g-1FWmin-1)PPOactivities=PPOactivities=(U.g-1FW)ε470=26.6mM-1㎝-12.4.6、逆境胁迫和谷胱甘肽(GSH)的含量测定GSH的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各1mL(空白用5%三氯乙酸代替)→分别加入2mL0.1MPBS(pH=7.7)→1mL2mMDTNB→25℃5min→测定A412。计算：GSHcontent=GSHcontent=(mol.g-1FW)ε412=13.6mM-1㎝-12.4.7、逆境胁迫和抗坏血酸(ASA)的含量测定ASA的提取：分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→上清液定容至5mL。测定：上清液各0.8mL(空白用5%TCA代替)→分别加入0.8mL0.15MNaH2PO4(pH=7.4)和蒸馏水→摇匀→分别加入0.8mL5%TCA、44%磷酸和4%联吡啶→摇匀→加入3%FeCl30.8mL→37℃15min→测定A525。计算：ASAcontent=ASAcontent=(mol.g-1FW)ε525=16.5mM-1㎝-13、结果与分析3.1、种子生命力（发芽率）的快速测定小麦的种子经过曙红染色，不具有生命力的由无色变为红色。其中50粒小麦种子中，6粒被染成红色，由此可以计算出发芽率：种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X100﹪种子发芽率=44/50X100﹪=88﹪小麦的种子经过TTC染色，具有生命力的由无色变为红色。其中50粒小麦种子中，28粒被染成红色，由此可以计算出发芽率：种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X﹪种子发芽率=28/50X100﹪=56﹪数据分析：相同的小麦种子在曙红染色和TTC染色所测定的种子发芽率分别为88%和56%，差异较大。分析其原因主要有两个发面，一个原因是曙红染液滴加的过少，以至部分不具有生命力的小麦种子着色较浅；另一个原因是曙红染色时间过短，部分不具生命力的小麦种子着色较浅，从而影响实验的数据结果。3.2、逆境胁迫和脯氨酸（Pro）的积累及测定在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520nm处有较高吸收峰。数据如下：小麦在干旱胁迫下和正常环境下脯氨酸的含量比较OD520(mol.g-1FW)对照组0.0940.290实验组1.2233.775由上图表可知：通过对照组与实验组小麦叶片中脯氨酸含量的对比，实验组小麦叶片脯氨酸含量远远高于对照组小麦叶片脯氨酸含量。实验研究表明：表明小麦幼苗经过干旱胁迫下，植物体通过蛋白质的降解、从头合成和降低脯氨酸脱氢酶活性等途径合成脯氨酸，导致脯氨酸（Pro）的大量积累。游离脯氨酸可能作为一种调节或者是信号分子来激活很多反应以适应逆境过程【7】。脯氨酸也是植物遇到逆境的一种可靠的指示器【8】。脯氨酸的积累还与自由基的非酶清除有一定的相关性，Alia等【9】。发现离体线粒体中,脯氨酸可减少高光强诱导下自由基的产生。在向日葵上的研究表明，干旱胁迫下各品种的脯氨酸含量均显著高于对照。本试验结果与此研究结果相符。脯氨酸主要是在线粒体中合成，主要分布于线粒体及胞质基质中，从而提高细胞质的渗透压平衡与细胞质与液泡间的渗透压，是渗透胁迫下的叶绿体和线粒体能维持较好的水分状况，保证光合作用和呼吸作用的运行。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性的品种往往积累较多的脯氨酸。因袭程度脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，能防止细胞脱水的作用。植物游离脯氨酸含量的增加是植物对逆境胁迫的一种生理生化反应，是植物在逆境下的适应表现。脯氨酸具有多种生理功能，如作为细胞质渗透调节物质、稳定生物大分子结构、降低细胞酸度以及作为能量库调节细胞氧化还原势等。许多植物在受到环境胁迫，例如在干旱、盐渍、低温等想条件下时，体内的脯氨酸含量发生很大变化。因此，通常把脯氨酸含量变化作为植物体内氨基酸代谢是否发生障碍的指标【10】。3.3、逆境胁迫和丙二醛（MDA）的测定硫代巴比妥酸与丙二醛、可溶性糖反应产物在不同的波长中具有吸收峰，依次来测定丙二醛和可溶性糖的含量。数据如下：小麦在干旱胁迫下和正常环境下丙二醛的含量比较OD450OD532可溶性糖（mmol/L）MAD含量（mmol/L）对照组0.2880.0903.37240.4192实验组0.4050.1814.74260.94065由上表可知：通过对照组与实验组可溶性糖和MDA的含量明显增加。实验研究表明：在干旱的胁迫下会使植物叶片MDA和可溶性糖大量积累。PEG模拟干旱胁迫使可溶性糖含量大幅提高。可溶性糖是生物体内重要成分之一,是生物体中的重要能源和碳源【11】。可溶性糖作为渗透调节物质可以降低细胞的渗透势以维持细胞的膨压,防止细胞内大量的被动脱水【12】。MDA在逆境胁迫条件下，植物往往发生膜脂过氧化作用.质膜相对透性的大小是膜伤害的重要标志之一。MDA是脂质过氧化的产物之一，其积累是活性氧毒害作用的表现。MDA含量通常被作为判断膜脂质过氧化作用的指标【13】。细胞膜透性和MDA含量的的变化是植物细胞膜脂透过反应的表现，MDA能与细胞内各种成分发生反应，从而引起细胞内各种膜的损伤，当MDA含量大量增加时，表明体内细胞受到严重的破坏，膜透性增加，细胞内物质外渗，细胞功能下降【14】。小麦幼苗在PEG溶液干旱处理后其MDA大量积累以增加其抗旱能力。可溶性糖：可溶性糖的含量在干旱胁迫下会加剧来抵抗干旱，能够通过渗透调节来提高作物的抗旱性。可溶性糖是植物体内的重要渗透调节产物之一，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，土壤水分减少时，随干旱胁迫程度增加而增加，有利于维持植物体细胞膨压，抑制由于细胞内水分过度损失而造成的被动脱水【15】。小麦幼苗在PEG溶液干旱处理后其MDA大量积累以增加其抗旱能力。3.4、逆境胁迫与H2O2的积累及测定干旱胁迫下，植物体内过氧化氢大量积累，作为胁迫信号启动适应生理过程。在酸性条件下（pH=1.6），H2O2将Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+进一步与二甲酚橙反应形成紫色的复合物Fe3+-XO，此复合物的最大波长为560nm，在一定范围内，其颜色深浅与H2O2含量呈线性关系。在此反应中加入山梨醇可提高测定H2O2的灵敏度。数据如下：小麦在干旱胁迫下和正常环境下过氧化氢的含量比较OD410含量(mol.g-1FW)对照组0.12830.476实验组0.441105.000由上图表可知：实验组中的过氧化氢含量是对照组过氧化氢含量的3倍多。实验研究表明：小麦幼苗在干旱胁迫的条件下叶片中的过氧化氢的含量大量增加。在干旱胁迫下，会引起叶绿体、线粒体、过氧化物体、细胞壁及质外体中的过氧化氢的大量积累。在正常环境和生理条件下，活性氧和抗氧化酶系处于动态平衡之中，维持低水平的活性氧稳态，在不良环境如干旱、低温盐渍等，可以打破这种平衡，其主要原因是干旱胁迫条件下，使光合作用CO2固定效应降低，导致更多的电子“渗透”，使分子氧还原成O-2，增加的活性氧对细胞的伤害主要是引起膜脂过氧化，产生丙二醛，以增加其抗旱能力。3.5、植物抗氧化酶活性的（POD、PPO）的活性测定POD活性邻甲氧基苯酚可被POD氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚。红棕色物质可用分光光度计在470nm处测定其值，即可求出该酶的活性。PPO活性邻苯二酚可以被PPO氧化成茶褐色的化合物，可用分光光度计在470nm处测定其值，即可求出该酶的活性。数据如下：小麦在干旱胁迫下和正常环境下POD活性的比较OD470（1min）活性值(mol.g-1FWmin-1)对照组0.963105.563实验组2.021227.932小麦在干旱胁迫下和正常环境下PPO活性的比较OD410（1min）活性值(U.g-1FW)对照组0.22814400实验组0.41020500由上图表可知：实验组中的POD活性和PPO活性均比对照组中的POD活性和PPO活性要高很多。实验研究表明：在干旱胁迫下，POD值升高，POD是植物抗氧化酶系统中重要的酶类，POD通过催化其他底物与过氧化氢反应以消耗过氧化氢，植物在受到水分胁迫及复水时，可诱导体内POD活性上升，从而起到保护植物的作用。POD活性在干旱胁迫下增强，能通过增强POD活性来抵御干旱逆境对其所造成的伤害【16】。多酚氧化酶（polphenoloxidase,PPO）是植物体内酚类物质氧化或缩合以及木质素的合成的重要酶，提高PPO活性可促进植物体内酚类物质和木质素的合成和积累以提高植物抗性【17】。PPO是一种与生长相关的酶，刘金龙等研究表明，PPO与仁用杏树生长发育以及抗逆性相关，是仁用杏树抗逆性生化指标，可作为栽培时选择树种的依据【18】。3.6、逆境胁迫和谷胱甘肽(GSH)的含量测定对硫二硝基苯酸与谷胱甘肽的反应产物，可用分光光度计在412nm处测定其值，即可求出谷胱甘肽（GSH）的含量测定）。小麦在干旱胁迫下和正常环境下谷胱甘肽含量的比较OD412含量(mol.g-1FW)对照组0.1532.250实验组0.5017.368由上表可知：实验组中谷胱甘肽（GSH）的含量比对照组中的谷胱甘肽（GSH）的含量大量增加。实验研究表明：在干旱胁迫下，GSH的值较正常情况下增高，这是因为还原性谷胱甘肽是生物细胞中含量最丰富的非蛋白质硫醇化合物。在生物体内不同的胁迫响应途径中，利用GSH是亲和活性来消除活性氧和重金属等对细胞的伤害。因此，在生物的氧代谢及抗逆生理中GSH发挥着重要的作用【19】。小麦在干旱条件下通过提高GSH含量来应激环境变化。在正常供水情况下，小麦不存在干旱胁迫所带来的伤害，其体内的GSH处在正常的代谢中，所以在整个测定过程中GSH含量变化比较稳定【20】。3.7、逆境胁迫和抗坏血酸(ASA)的含量测定Fe3+可以被抗坏血酸还原成Fe2+，Fe2+与联吡啶生成粉红色Fe2+-联吡啶复合物，可用分光光度计在525nm处测定其值，即可求出该物质的含量。小麦在干旱胁迫下和正常环境下抗坏血酸含量的比较OD525抗坏血酸(mmol.g-1FW)对照组0.1001.515实验组0.1322.000由上表可知：实验组中抗坏血酸(ASA)的含量比对照组中抗坏血酸(ASA)的含量增多。实验研究表明：在干旱胁迫的条件下，植物叶片抗坏血酸含量有所增加，以抵抗干旱胁迫。抗坏血酸在植物体内的氧化还原状态以及维持该状态所涉及代谢物质和酶系的水平或活性的改变，对植物抵抗一系列环境胁迫非常重要。4、结论通过本次实验，从结果中可以看出，小麦为了适应干旱胁迫的逆境，机体内发生了一些列的生理生化反应，试验中脯氨酸(Pro)的积累说明植物正常的生理机能已经被干旱胁迫所破坏。脯氨酸(Pro)是植物蛋白质的组分之一，并可以游离状态广泛存在于植物体中。在干旱胁迫条件下，许多植物体内脯氨酸大量积累。积累的脯氨酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外,还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。试验数据显示，除脯氨酸(Pro)外，受到干旱胁迫时小麦叶片内的抗氧化酶、谷胱甘肽、过氧化氢、可溶性糖、丙二醛等含量显著增加，说明小麦幼苗通过大量积累这些物质以调节生理变化。对抗逆研究植物干旱胁迫条件下其发芽率、抗氧化酶、脯氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、可溶性糖、丙二醛等生理生化指标含量的变化，并初步探讨小麦的抗逆机理，能够应用于农业生产实践中，为干旱农业生产提供理论依据。5、参考文献[1]于景华，王丽娟，唐中华，等.植物对干旱胁迫的生理和分子反应[J].代化农业.2006.12：1-4.[2]杨帆，苗灵凤，胥晓，等.植物对干旱胁迫的响应研究进展[J].应用与环境生物学报.2007,13(4)：586-592.[3]鲁萍，桑卫国，马克平.外来入侵种飞机草在不同环境胁迫下抗氧化酶系统的变化[J].生态学报.2006,26(11)：3578-3585.[4]王红梅，包维楷，李芳兰.不同干旱胁迫强度下白刺花幼苗叶片的生理生化反应[J].应用与环境生物学报.2008,14(6)：757-762.[5]MittlerR.Oxidativestress,antioxidantsandstresstolerance[J],TrendsPlantSci,2002,7(9):405-410.[6]李芳兰，包维楷，吴宁.白刺花幼苗对不同干旱胁迫的形态与生理响应[J].生态学.2009,29(10)：5406-5416.[7]MaggioA,MiyazakiS,VeroneseP,etal,Doespro2lineaccumulationplayanactiveroleinstress2inducedgrowthreduction?[J].PlantJournal,2002,31(6):6992712[8]ClaussenW,Prolineasameasureofstressintomatoplants[J].PlantSci,2005,168:2412248.[9]Alia,PrasadKV,SaradhiPP,EffectofzineonfreeradicalandprolineinBrassicaandcajanus[J],Phytochem,1995,39:45247[10]覃光球，严重玲，韦莉莉.秋茄幼苗叶片单宁、可溶性糖和脯氨酸含量对Ｃd胁迫的响应.生态学报.100020933（2006）1023366206[11]DureL.P1antresponsestocellulardehydrationdur2ingenvironmentstress[J],PlantPhysiology,1993,103(10):91293.[12]CechinI.RossiSC,OliveiraVC,etal.Photosyn2theticresponsesandprolinecontentofmatureandyoungleavesofsunflowerplantsunderwaterdeficit[J],P