GB/T 43160-2023 梨火疫病菌检疫鉴定方法（正式版）

ICSCCS65.020.20梨火疫病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofErwiniaamy国家标准化管理委员会国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会IGB/T43160—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、塔里木大学、三亚中国检科院生物安全中心、上海海1GB/T43160—2023梨火疫病菌检疫鉴定方法害的田间调查与监测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。本文件没有需要界定的术语和定义。输工具等多种自然因素及人为因素均可引起梨火疫病的传播。其中，染病的植物繁殖材料是梨火疫病远距离传播的主要途径。梨火疫病菌的其他信息参见附录A。5方法原理根据梨火疫病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据梨火疫病菌的特异性DNA序列6仪器设备和主要试剂2×PCR反应预混液、2×荧光PCR反应预混液等，缓冲液及培养基按附录B配制，除另有规定2GB/T43160—20237检疫鉴定方法7.1症状检查检查植株有无梨火疫病的典型症状见附录A中的症状描述，早春为重点监测时期。主要检查嫩否从叶柄基部向上变黑；枝干是否有溃疡斑以及病组织上是否有菌脓。对出现典型症状或疑似症状的状的幼嫩枝条，应重点对其顶端和基部取样。7.2样品的制备样品采集后应尽快检测，若不能及时检测，样本应在4℃~8℃下保存，尽可能不超过一周。采集样品以及在运输和处理过程中应注意避免交叉污染。样品处理应采用分离培养、免疫学和分子生物学检测都有效的通用程序。样品用无菌蒸馏水或pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)处理，直接用于分离培养、免疫学或分子生物学检测。尽量选择表现出最典型症状并带有菌脓的植物部位(花朵、嫩梢、幼枝、叶片或果实)。挑取病健交界部位的植物组织，切成约0.1g～1.0g的小块，放入装有适量PBS或无菌蒸馏水的离心管或培养皿中研磨或挤压，静置至少5min,制成样品悬浮液，用于后续分离培养、免疫学检测及分子生物学检测。7.2.2无症植株样品的制备无症状样品宜单个处理，或者最多10个一组。样品处理和提取过程中小心避免交叉污染。开花期开始至果实膨大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，装入无菌袋或容器中。从待检植株上剪下长度约为20cm的嫩梢或花期时的花器。如果在冬天进行采样检测，从每株植物上采集5个～10个花蕾。在实验室内，从挑选的植株上剪下花期时的花器、花梗和嫩梢下部几个叶片的叶柄基部或茎段。称取0.1g～1.0g植物材料，浸渍在7.2.1描述的无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液中，制成样品悬浮液。处理由多个植物材料组成的样品时，可将其放入装有适量PBS或无菌蒸馏水的无菌三角瓶中，置于摇床中室温剧烈振荡1h,制成样品悬浮液，可直接用于后续分析，也可将悬浮液转移至50mL离心管中12000r/min离心20min,弃上清液，向沉淀中加入2mL无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液使其重新悬7.3免疫学检测对于疑似症状样品，如新鲜的叶片、幼果等，可利用商品化免疫胶体金试纸条进行采用商品化酶联免疫吸附测定(ELISA)方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。若检测结果为阴性，直接判定为未检出梨火疫病菌。若检测结果为阳性，需进行分离培养鉴定及致病性测定。亦可不进行免疫学检测，直接进行分子生物学检测。7.4分子生物学检测对于植株样品，按照步骤7.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明书提取样品总DNA,—20℃保存备用。对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后(取适量菌悬液于1.5mL离心管中，97℃3GB/T43160—2023沸水浴10min;12000r/min离心10min,取上清液，-20℃保存)作为分子生物学检测反应模板。7.4.2PCR凝胶电泳检测以E.amylovora标准菌株作阳性对照，以非E.amylovora的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，同时利用靶标在梨火疫病菌质粒pEA29及染色体基因上的两对特异性扩增引物对待测样品进行PCR扩增及凝胶电泳检测，具体检测步骤按附录C执行。7.4.3实时荧光PCR检测实时荧光PCR检测具体步骤按附录D执行，对照设置同7.4.2。7.5分离培养鉴定按照步骤7.2的方法制备成样品悬浮液或样品富集液后，用灭菌接种环醮取悬浮液于超净工作台内在LB培养基平板上划线分离，或者用无菌水对样品悬浮液进行10倍梯度稀释，各取100μL稀释液涂板分离，各重复3次。将培养基平板放置于恒温培养箱内，25℃恒温培养24h～48h,挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行致病性测定、Biolog鉴定、免疫学或分子生物学鉴定。在LB培养基上，梨火疫病菌形成乳白色菌落，菌落较大而凸起，光滑呈透镜状，而常见的污染菌草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)在LB培养基上则形成黄色菌落。7.6Biolog鉴定分离物在培养后转移至BUG培养基上，30℃下培养24h,按照Biolog使用说明，调整分离物菌悬。微孔板30℃下培养18h后用7.7致病性测定取梨幼果(直径约3cm～5cm)洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置垫有灭菌滤纸的培养皿上(加少量无菌水)。用接种针蘸取在LB培养基上培养24h～36h的待鉴定菌落，针刺接种到幼果的果肉组织，一个横切面接种3个～4个点。接种后，26℃保湿培养，诱导发病和菌脓的形成。24h后，观察接种部位有无坏死和菌脓产生。实验以无菌水为对照。剪取梨树当年生的幼嫩枝梢，插于盛有自来水的三角瓶中，用接种针蘸取在LB培养基上培养24h～36h的待鉴定菌落，刺伤接种到顶端生长点下约5cm～10cm处；也可刺伤后，在刺伤点接种1滴(3μL～5μL)浓度为10⁷CFU/mL的病菌悬浮液。接种后套袋25℃左右保湿培养，2d～3d后观察接种点是否出现变黑、组织干瘪、枝梢萎蔫等症状及是否出现菌脓。8结果判定对于有典型症状的植株样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出梨火疫病菌。对于无症状样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性，初步判定为检出梨火疫病菌，若分离培养出典型菌落，Biolog鉴定为阳性或致病性测定出现典型症状，则确定检出梨火疫病菌。其中，分子生物学检测可根据实验室条件，按照7.4.2或7.4.3进行，任意一种检测方法的结果为阳4GB/T43160—2023性则判定分子生物学检测结果为阳性。致病性测定可根据实验室条件，按照7.7.1或7.7.2进行，任意一种测定方法出现典型症状则判定致病性测定结果为阳性。9样品及资料保存9.1样品及菌种保存样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨火疫病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后再处理。从检测样品中分离并鉴定为梨火疫病菌的菌株，应妥善保存。可采用甘油保存于超低温冰箱或冻干保存。对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。9.2结果记录与资料保存员的签字。现场检疫发现的可疑症状、培养基上的菌落特征和人工接种的典型症状等应及时拍照保存，酶联免疫方法应有酶联反应的原始数据，PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片，荧光PCR检测应有原始数据。5GB/T43160—2023(资料性)A.1名称与分类地位分类地位：细菌界(Bacteria),变形菌门(Proteobacteria),γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria),肠杆菌目(Enterobacteriales),肠杆菌科(Enterobacteriaceae),欧文氏菌属(Erwinia)。A.2地理分布A.3寄主范围唐棣属(Amelanchier)[桤叶唐棣(A.alnifolia)、加拿大唐棣(A.canadensis)、平滑木瓜属(Chaenomeles)[日本木瓜(C.japonica)、贴梗海棠(C.lagenaria)、木瓜(C.sinensis)]、枸子属(Cotoneaster)[(匍匐枸子(C.adpressus)、藏边枸子(C.affinis)、四川枸子(C.ambigena)、细尖枸子(C.apiculata)、泡叶枸子(C.bullatus)、多花泡叶枸子(C.bullatusvar.floribundus)、黄杨叶枸子6GB/T43160—2023carpus)、小叶枸子(C.microphyllus)、光泽枸子(C.nitens)、暗红枸子(C.obscurus)、毡毛枸子柿(Diospyroskaki)、君迁子(Diospyroslotus)、云南移(木衣)(Docyniadelavayi)、枇杷属(Eriobotrya)[(枇杷(E.japonica)]、草莓属(Fragaria)[智利草莓(F.chiloensis)]、虫菊(Fragariavirginiana)、加州黑胡桃(Juglanscalifornica)、印度黑胡桃(Juglanshindsii)、黑胡桃(Juglans(M.microm.)、楸子(M.prunifolia)、苹果(M.pumila)、西伯利亚海棠(M.robusta)、三叶海棠根尼李(Prunusalleghaniensis)、杏(Prunusarmeniaca)、欧洲甜樱桃(Prunusavium)、比西氏樱salicina)、杏李(Prunussimonii)、美国稠李(Prunusvirginiana)、火棘属(Pyracantha)[窄叶火棘毛草原蔷(R.setigera)]、悬钩子属(Rubus)[复盆子(R.idaeus)]、花楸属(Sorbus)[美洲花楸(S.(Stranvaesiadavidiana)[波叶红果树(S.davidianavar.undulata)]。A.4危害症状b)枯梢和枯枝：病菌侵染当年生新梢(以春梢为主),侵入点最初表现为表皮变黑，病斑向上下扩GB/T43160—2023梨火疫病在梨树上的危害症状与亚洲梨火疫病无十分明显的差别，唯一的症状区别是典型的梨火图A.2果柄菌脓症状图A.3幼枝叶片干枯症状图A.4枝条8GB/T43160—2023(规范性)缓冲液及培养基的配制氯化钠(NaCl)8.0g;氯化钾(KCl)0.2g;十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g;磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g;蒸馏水加至1.0L,搅拌混匀至溶解。B.2LB培养基胰蛋白胨10.0g;酵母浸膏5.0g;氯化钠(NaCl)10.0g;琼脂15.0g;蒸馏水加至1.0L,调节pH到7.5,湿热灭菌(121℃,20min)。B.3BUG琼脂培养基BUG琼脂培养基57.0g,蒸馏水加至1.0L,调节pH到7.4,湿热灭菌(121℃,20min)。9GB/T43160—2023(规范性)PCR凝胶电泳检测PCR检测引物见表C.1。引物名称引物序列退火温度产物大小pEA29A5'-CGGTTTTTAACGCTGGG-3'约1kbpEA29B5'-GGGCAAATACTCGGATT-3'FER1-F5'-AGCAGCAATTAATGGCAAGTATAGTCA-3rgER2-R5'-AAAAGAGACATCTGGATTCAGACAAT-3′PCR反应程序为94℃5min;94℃30