《仪器分析》课件-8高效液相色谱法

高效液相色谱法高效液相色谱仪01PARTONE第一节高效液相色谱仪

高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入待分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。贮液器高压泵检测器梯度淋洗装置色谱柱压力表进样器馏分收集器高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统

由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、高压输液泵、过滤器等组成。对高压输液泵的要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。1.高压输液系统

储液罐：

材料应耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）。溶剂约为0.5－2.0L。储液罐放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程储液罐应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的变化，还可防止空气中氧气、二氧化碳重新溶解于已脱气的流动相中。

对输出流动相的连接管路，其插入储液罐的一端，通常连有孔径为0.22μm的多孔不锈钢过滤器或由玻璃制成的专用膜过滤器。

溶剂泵过滤高压输液泵泵体材料能耐化学腐蚀；能在高压下连续工作；输出流量范围宽（0.1－10ml/min）；输出流量稳定。

常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍通常使用耐高压的六通阀进样装置:

2．进样系统

准备状态进样状态流动相入口色谱柱入口样品出口样品入口流动相入口色谱柱入口样品环进样器3分离系统——色谱柱

色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm。

对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。

品牌填料C18/C8（直径×长度，粒径）如：AgilentZorbaxSB-C18(4.6×250mm,5μm)使用色谱柱注意事项：1溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤,防止堵塞。2更换流动相要渐变。3用后要保护好。4．检测系统

HPLC与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点

检测器分为两大类：一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。

另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器（UV）优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量10-9g·mL-1。缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。

检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（3）荧光检测器（4）电导检测器

（2）示差折光率检测器

它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。HPLC梯度淋洗与GC中的程序升温一样。

对于某些复杂样品，组分的k′范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。就是组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、pH、离子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和tR，提高分离效果和分析速度。5、附属系统梯度淋洗装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。溶剂过滤：选用水或油膜，0.22μm。

装柱：分清正反，按照箭头方向。打开仪器各部件：检测正常。开计算机，打开工作站排气：管路中无气泡，甲醇或乙腈平衡色谱柱：半个小时。流动相：平衡半个小时。进样：微量进样器，慢推快扳。洗柱：甲醇或乙腈半个小时，如用缓冲盐，先用10％甲醇－水或10％乙腈－水冲洗一个小时，再换用甲醇或乙腈冲洗半个小时。关闭计算机和仪器混合样品流动相流动方向ABCABC固定相

——柱内填料流动相——洗脱剂固定相流动相流动相安捷伦：Agilent沃特世：Waters戴安：Dionex岛津：Shimadzu液相色谱中的固定相和流动相02PARTTWO第二节高效液相色谱的固定相和流动相

（一）固定相

高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。它是目前最广泛使用的一种固定相。

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。

1.表面多孔型固定相

它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。

这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。

2．全多孔型固定相

它由直径为10µm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析.（二）流动相

由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。

如：对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（3）高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等。流动相及流动相的极性

（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。

液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。流动相组