TSPPHN 002-2024 十字花科蔬菜病毒病综合防控技术规程

ICS01.040.65CCSB15/19湖南省植物保护学会团体标准T/SPPHN002-2024十字花科蔬菜病毒病综合防控技术规程CodeofPreventionTechnologyoftheCruciferaeVegetableViralDiseases2024-06-05发布 2024-06-05实施湖南省植物保护学会 发布T/SPPHN002-2024T/SPPHN002-2024前 言本文件是根据GB/T1.1-20201本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位为湖南省植物保护研究所全国农业技术推广服务中心山东省农业科学院植物保护研究所、云南农业大学、江苏省农业科学院植物保护研究所、中国农业科学院植物保护研究所 。IT/SPPHN002-2024T/SPPHN002-2024PAGEPAGE1十字花科蔬菜病毒病综合防控技术规程范围本标准适用于大白菜、萝卜、油菜、卷心菜等十字花科蔬菜病毒病的综合防控。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB4285 农药安全使用标准GB8321 农药合理使用准则NY/T393 绿色食品农药使用准则术语和定义GB/T35333和界定的以及下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本标准。综合防控技术 SyntheticalpreventioncontroltechnologyCruciferaevegetables茄科蔬菜主要包括大白菜、萝卜、油菜、卷心菜等蔬菜。virusdisease（RNA或DNA）和蛋白外壳复制并组成新病毒粒子，粒子在植物维管束中迅速移动致使植物周身感染并发病。发生流行规律十字花科蔬菜病毒病主要由芜菁花叶病毒引起、其次由黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒等病毒引起。TuMV和CMV均可由蚜虫和汁液接触传染，而TMV主要是靠汁液接触传染。接触传染病毒病流行规律虫传病毒病流行规律病害诊断病害田间诊断A）。萝卜感病后，多整株发病呈现各种症状（A），叶片出现叶色不均匀，深绿和浅绿相间，（A）。生物学检测B.1。分子生物学检测采用硅粒吸附法提取植物总RNA。以硅粒吸附法提取的总RNA为模板，选取随机引物进行反转录（RT）cDNAAlphaB.3。防治原则“”的指导思防治方法种植抗病品种选种及种子消毒选种种子消毒3-410%20-307072h，经检查发芽率正常后备用。农业防治合理间、套、轮作尽量不与十字花科作物邻作，与早、中甘蓝地保持一定距离。选用空茬地或倒茬地，合理轮作，2-3适期播种清洁田园，加强管理一茬白菜、萝卜或甘蓝等蔬菜收获后，很多病菌附着于残叶上，应彻底清除这些田间残枝败叶及残根，平常也应及时清除田间及周围的十字花科杂草。注意防病，及时拔除病株，接触过病株的手和工具，要及时用肥皂水或磷酸三钠水溶液冲洗。水肥管理苗期不能缺水，“三水齐苗、五水定棵”，以小水勤灌为宜，即播后浇第1次水，幼苗出土时浇第2次水，幼苗出齐后浇第3次水，4-5片真叶时浇第4次水，7-8片真叶时浇第5次水，这样可促进壮苗，增强苗期抗逆性，同时又可防止地温升高，是防治病毒病的有效措施。如遇到雨天，还要及时排水防涝。N肥、及时蹲苗，促进幼苗生长，增强植株抗病能力。物理防治银灰膜避虫根据蚜虫对银色的忌避性，在蚜虫发生期，苗床及菜田采用银色反光膜驱蚜。每亩（30~40）条。色板诱杀利用蚜虫对黄色或绿色有较强趋性的特性，在田间放置30cm×40cm的诱虫黄板或绿板300块hm220cm左右，黄板或绿板粘满害虫后及时更换。农药防治在上述措施无法控制在病毒病和传毒害虫经济阀值以下，且病毒病和传毒害虫出现大面积爆发时，采用农药防治。农药使用应符合国家绿色食品农药使用准则。农药防治病毒病菜生育期普遍较短，一般只有30-50天，因此采收之前7-10天，必须停止用药。防治病毒病常用药剂的用量及用法见附录C。农药防治蚜虫（5~15）%C。深化病虫测报，确保统防统治建立防控档案在田间调查十字花科病毒病发生情况时，具体调查内容见附录D。T/SPPHN002-2024T/SPPHN002-2024PAGEPAGE10附录A（资料性附录）十字花科作物病毒病症状A）。A1辣椒病毒病为害症状萝卜感病后，多整株发病呈现各种症状（A），叶片出现叶色不均匀，深绿和浅绿相间，A2萝卜病毒病为害症状（A）。A3油菜病毒病为害症状附录B（规范性附录）病毒病检测方法病毒生物学检测病毒摩擦接种方法（200~400）目撒到待接种叶的表面（也可直接将金刚砂加在研磨液中），在营养钵内插上标签，注明处理及时间；（22~25℃）病毒的保存将经过三次单斑纯化后毒源，再次接种至系统寄主上，待其出现系统症状后，取发病叶片使用冷冻干燥的方法处理后，写明标签，存于-80℃冰箱。将经分离纯化后得到的不同病毒的病毒分离物分别接种至病毒敏感植物上，观察其症状(见图B1、图B2、图B3)。aab图B1CMV分离物接种至苋色藜上的症状（a）：枯斑；接种至心叶烟上的症状（b）：系统花叶。aab图B2TMV分离物接种至心叶烟上的症状（a）：枯斑；接种至三生烟上的症状（b）：系统花叶。分子生物学检测GB4.0M 异硫氰酸胍0.2M NaAc（pH5.2）25mM EDTA(pH8.0)1M KAc2.5%（W/V） PVP-4010NLS将1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。WB1mM EDTA(pH8.0)20mM Tris-HCl(pH7.5)10mM NaClNaI6M NaI0.15M Na2SO3硅溶液将60g二氧化硅溶于500mL水中，静置24h，倒掉470mL上清，再加水至500mL，静置5h，倒掉440mL上清，用HCl将剩下的60mL沉淀调pH值至2.0，高压灭菌后，200μL/管分装，-20℃保存。RNA采用硅粒吸附法提取植物总RNA。取病叶0.1g，加3mLGB溶液，研磨至匀浆；取500μL研磨液，加100μLNLS，70℃温育10min，不时上下颠倒混匀，冰上放置5min，13000rpm/min离心10min；取300μL150μL无水乙醇，300μLNaI，25μL10min；6000rpm/min离心1min，倒去上清；加500μL洗涤液（WB:无水乙醇=1:1）洗涤，6000rpm/min离心1min，ddH2O150μL,70℃温育4rpm/min离心3min，取上清，-20℃保存。扩增反转录RNA转录合成cDNA链具体反应体系及步骤见表B1。表B1病毒反转录体系试剂体积TotalRNA7μLRandomPrimer1μL2×TSReactionMix10μLRIEnzymeMix1μLgDNARemover1μL总体积20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min，-20℃保存。反应引物TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR引物见表B2。表B2TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR引物病毒名称（前引/后引）引物序列片段长度TuMVTuMV-FTAAACGGAATGTGGGTGATGATGG333bpTuMV-RGTCCTCGGTCGTATGCCTTTCCCMVCMV-FATGGACAAATCTGRATCWMCC764bpCMV-RCTGGATGGACAACCCGTTCTMVTMV-FCGGTCAGTGCCGAACAAGAA690bpTMV-RATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT(K=G或T；W=A或T；V=A，C或G；S=G或C；Y=C或T；R=A或G；B=G，C或T)反应体系TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR引物反应体系见表B3表B3CMV、TMV特异性RT-PCR引物反应体系试剂体积10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP1.6μL前引1.0μL后引1.0μL酶0.3μLcDNA1.0μL加水定容至20μL反应程序TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR反应程序见表B4表B4CMV、TMV的特异性RT-PCR反应程序病毒名称反应程序TuMV9447min。CMV94℃47minTMV94℃预变性4延伸7min琼脂糖凝胶电泳1%5µL扩增反应物与2mLSYBRGreen3mLloadingbufferV，电泳30min。目的片段的克隆与分析AlphaB4B5、图.6。图B4十字花科作物携带TuMV的检测B5CMV的检测B6TMV的检测附录C（规范性附录）农药防治传毒害虫及病毒病一览表表C1农药防治传毒害虫及病毒病一览表病虫害防治农药使用剂量使用方法防治时期病毒病20%盐酸吗啉胍.乙酸铜500-600倍液喷雾病情指数≧5%0.5%菇类蛋白多糖水剂200-300倍液喷雾沼泽红假单胞菌悬浮剂200倍液喷雾或浸种嗜硫小红卵菌悬浮剂200倍液喷雾或浸种1.5%烷醇.硫酸酮800-1000倍液喷雾2%宁南霉素水剂500倍液喷雾30%毒氟磷可湿性粉剂500倍液喷雾2%氨基寡糖素213-267毫升/亩喷雾蚜虫50%抗蚜威可湿性粉剂3000倍液喷雾有虫率≧5%0.6%苦参碱水剂800-1000倍液喷雾10%吡虫啉可湿性粉剂3000