T-SHAAV 022-2024 饲料添加剂 蛋清溶菌酶寡聚体T-SHAAV 022-2024 饲料添加剂 蛋清溶菌酶寡聚体

ICS65.120CCSB20T/SHAAV团体标准T/SHAAV022—2024饲料添加剂蛋清溶菌酶寡聚体FeedadditivesEggwhitelysozymeoligomer2024-04-10发布2024-04-10实施上海市畜牧兽医学会发布T/SHAAV0222024前言本文件按照GB/T1.12020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心、上海艾魁英生物科技有限公司、上海新农科技股份有限公司。本文件主要起草人:顾欣、张好、商军、姜芹、孙冰清、张亦菲、黄士新、曹莹、吴雨珊、张浩然、张文刚、严凤、黄家莺、吴剑平、张婧、徐汀、陶玉洁、华贤辉、田恺、方雅红、黄易明、黄润超、刘翠、尹翠凤、王听蕾、陈英杰。本文件首批承诺执行单位名单:上海市动物疫病预防控制中心、上海艾魁英生物科技有限公司、成都礼顿农牧科技有限公司、上海华易动物保健品有限公司、佛山市正典生物技术有限公司、上海新农科技股份有限公司。lT/SHAAV0222024饲料添加剂蛋清溶菌酶寡聚体本文件规定了饲料添加剂蛋清溶菌酶寡聚体的技术要求、检验规则、标签、包装、运输、贮藏和保质期,描述了试验方法。本文件适用于以蛋清溶菌酶为原料,经聚合反应而得的饲料添加剂蛋清溶菌酶寡聚体。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6435饲料中水分的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB10648饲料标签GB/T13079饲料中总砷的测定GBT13080饲料中铅的测定原子吸收光谱法GB/T13082饲料中镉的测定GB/T13091饲料中沙门氏菌的测定GB/T14699饲料采样GB/T17480饲料中黄曲霉毒素B,的测定酶联免疫吸附法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。蛋清溶菌酶寡聚体eggwhitelysozymEOligoMEr以蛋清溶菌酶单体为原料,使用蛋白质交联剂进行聚合反应后产生寡聚体,其含有蛋清溶菌酶二聚体、三聚体、四聚体和蛋清溶菌酶单体。3.2酶活力单位theactiveunit在25℃和PH6.2的条件下,使藤黄微球菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光度下降0.001所需蛋清溶菌酶的量为一个蛋清溶菌酶活力单位(U)。T/SHAAV02220244技术要求4.1外观与性状微黄色颗粒状物,流散性好,无发霉,无变质,无异味,无异嗅。4.2技术指标应符合表1的要求。表1技术指标项日指标蛋溶酶寡聚体酶活力/(u/mg)≥500蛋清溶菌酶二聚体(占比)/(%)≥30蛋清溶菌酶二聚体(占比)/(%)≥20蛋清溶菌酶聚体(占比)/(%)≥蛋清溶菌酶单体(占比)/(%)≤水分/(%)≤总砷/(mg/kg)≤铅(以pb计)/(mg/kg)≤镉(以cd计)/(mg/kg)≤黄曲毒素B1/(ug/kg)≤沙门氏菌/(25g样品中)不检出注:占比指各组分占蛋清溶菌酶寡聚体总蛋白质量的百分比。5采样按GB/T14699的规定执行。6试验方法6.1外观与性状取适量试样置于清洁干燥的白色瓷盘中,在自然光下观察其色泽和性状。6.2蛋清溶菌酶寡聚体酶活力按附录A的规定执行。6.3蛋清溶菌酶二聚体、三聚体、四聚体和单体占比按附录B的规定执行。6.4水分按GB,/T6435的规定执行。2T/SHAAV02220246.5总砷按GB/T13079的规定执行。6.6铅按GB/Tl3080的规定执行。6.7镉按GB,/T13082的规定执行。6.8黄曲霉毒素B1按GB,/T17480的规定执行。6.9沙门氏菌按GB,/'T13091的规定执行。7检验规则7.1组批以相同材料、相同生产工艺、连续生产或同一班次生产的同一规格的产品为一批,每批产品不得超过1000kg。7.2出厂检验出厂检验项目为外观与性状、水分、蛋清溶菌酶寡聚体酶活力、蛋清溶菌酶二聚体、三聚体、四聚体和蛋清溶菌酶单体占比,每批出厂产品应附有质量检验合格证(章)和使用说明。型式检验项目为第4章的全部要求。产品正常生产时,每半年至少进行1次型式检验。但有下列情况之一时,亦应进行型式检验:a)产品定型投产时;b)生产工艺、配方或主要原料来源有较大改变,可能影响产品质量时;C)停产3个月以上,重新恢复生产时;d)出厂检验结果与上次型式检验结果有较大差异时;e)饲料行政管理部门提出检验要求时。7.4判定规则7.4.1所检项目全部合格,则判定该批次产品合格。7.4.2检验结果中有任意一项指标不符合规定时,可自同批次产品中重新加倍取样复检,若复检有一项结果不符合规定,则判定该批次产品不合格。微生物指标不得复检。3T/SHAAV02220247.4.3数值修约按GB/T8170规定执行。8标签、包装、运输、贮存和保质期按GB10648的规定执行。8.2包装包装材料应采用无毒、无害,对产品质量无影响的材料。运输过程应防止包装破损、日晒、雨淋,禁止与有毒有害物质或强碱性、含碘物质混装混运。8.4贮存贮存时仓库应通风、干燥、能防暴晒、防雨淋,有防虫、防鼠设施,不得与有毒有害的物质混储。8.5保质期未开启包装的产品,在规定的运输、贮存条件下,自生产之日起保质期为12个月。4T/SHAAV0222024附录A(规范性)蛋清溶菌酶寡聚体酶活力测定方法A.1方法原理蛋清溶菌酶寡聚体可水解细菌的细胞壁,引起藤黄微球菌悬浊液的吸光值下降,根据25℃和PH6.2条件下,450nm处藤黄微球菌悬浊液下降的吸光值,从而计算出蛋清溶菌酶寡聚体酶活力。A.2仪器和设备A.2.1天平:精度为0.00018精度为0.1goA.2.2磁力搅拌器:搅拌转速50r/Min1500r/MinoA.2.3细胞研磨器:5mL。A.2.4可见分光光度计:精确度±0.001。A.2.5恒温培养箱:37℃±1℃。A.2.6PH计:精确度40.1。A.3试剂和材料本方法所用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中二级水的要求。A.3.2.1柠檬酸一水合物(CH807·H20).A.3.2.2柠檬酸三钠二水合物(C6H5Na307·2H20)。A.3.2.3磷酸二氢钠二水合物(NaH2P04·2H20)。A.3.2.4磷酸氢二钠十二水合物(Na2HPO,:12H20)。A.3.2.5乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。A.3.2.6藤黄微球菌粉:ATCC4698aA.3.3溶液配制A.3.3.1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L,PH6.6):称取4.20g柠檬酸一水合物,加水定容至200ML,制成柠檬酸溶液;称取5.88g柠檬酸三钠二水合物,加水定容至200mL,制成的柠檬酸钠溶液。取14mL柠檬酸溶液与186mL柠檬酸钠溶液混合,混匀。5T/SHAAV0222024A.3.3.2磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,PH6.2):称取11.70g磷酸二氢钠二水合物、7.86g磷酸氢二钠十二水合物及0.372g乙二胺四乙酸二钠,加水定容至1000mL。缓冲溶液PH为6.2±0.1。A.3.3.3底物溶液:藤黄微球菌用细胞研磨器研磨,用磷酸盐缓冲液制备50mL藤黄微球菌悬浊液,使用前,将菌悬液于37℃培养30min,2h内使用。以磷酸盐缓冲液调节分光光度计零点,调节底物浓度,使其450nm处的读数为0.70±0.10A.4试样制备及测定A.4.1试样溶液制备平行做两份试验。称取样品120Mg(精密至1Mg),置于250ML烧杯中,加入100ML柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,磁力搅拌约4h溶解,即得。A.4.2试样测定于(25±1)℃室温下,以磷酸盐缓冲液调节分光光度计零点。精确量取2.9mL底物溶液(450nm处吸光度为0.70so.10)于1cm比色皿,3min之内吸光度值变化≤0.003时,开始测定。精确量取0.1mL试样溶液加入底物溶液,充分混合,记录3min内吸光度值的变化,每1Min记录一次吸光度值。每分钟吸光度值变化应在0.030~0.080。如不在要求范围,需调整试样溶液的浓度,重复操作测定试样溶液。A.5结果计算试样中蛋清溶菌酶寡聚体酶活力X以活力单位每毫克(U/mg)表示,按公式(A.1)计算:式中:Ai试样在450nM处反应第1Min时的吸光值;A2试样在450nm处反应第3min时的吸光值;t数值为2,即获得第1Min和第3min吸光度读数所用的时间,单位为分钟(min);m0.1mL试样溶液中含有的蛋清溶菌酶寡聚体质量,单位为毫克(mg);0.o0l由单位蛋清溶菌酶寡聚体每分钟引起吸光度降低的值。所得结果表示至小数点后一位。A.6精密度在重复条件下,两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。T/SHAAV0222024附录B(规范性)蛋清溶菌酶寡聚体测定方法使用SDS法(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳),试样经电泳后,用全自动凝胶图像分析系统对蛋清溶菌酶寡聚体进行组分分析,从而计算出蛋清溶菌酶寡聚体中各组分占总蛋白质量的百分比。B.2仪器设备B.2.1全自动凝胶图像分析系统。B.2.2天平:精度为0.0001g、精度为0.1g。B.2.3磁力搅拌器:搅拌转速50r/min1500r/min.B.2.4离心机:不低于18000r/minoB.2.6电泳槽:73mmx83mm。B.2.7移液器:1000u1;1001;20uL。B.3试剂和材料除另有说明。本方法所用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中二级水的要求,SDS蛋白凝胶按表B.1配制,凝胶染色、脱色试剂按B3.3配制或用商品化产品。B3.2.1柠檬酸一水合物(CH807·H20)。B3.2.2柠檬酸三钠二水合物(C6H5Na307·2H20)。B3.2.3氯化钠(Nacl)。B3.2.4氢氧化钠(NaoH)。B3.2.5三氯乙酸(C2HC302)。B3.2.6乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。B3.2.7盐酸(HC1)。7T/SHAAV0222024B3.2.8丙酮(C3H:0)B3.2.9冰醋酸(C2H,02H)。B3.2.10磷酸(H3P04)。B3.2.11硫酸铵{(NH1)2SO]。B3.2.12过硫酸铵{(NH4)2S208}。B3.2.13甲醇(CH30H)。B3.2.14乙醇(C:H50H)。B3.2.15丙三醇(C3H803)。B3.2.16甘氨酸(C2H5NO3)。B3.2.17三羟甲基氨基甲烷(C4HiiNO3):生化级。B3.2.18β-硫基乙醇(C2H:0S):生化级。B3.2.19丙烯酰胺(C3H5NO)。B3.2.20N-N'-亚甲基双丙烯酰胺(C7HioN202):生化级。B3.2.21十二烷基磺酸钠(C2H25S03Na):生化级。B3.2.22N,N,N,N'-四甲基乙二胺(CHiN2):生化级。B3.2.23溴酚蓝(CHOBr105S)。B3.2.24考马斯亮蓝R-250。B3.2.25蛋白质分子量标准物:14.4KDa~97.4KDaoB.3.3溶液配制B3.3.1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mo1/L,PH6.6):称取4.20g柠檬酸一水合物,加水定容至200ML,制成柠檬酸溶液;称取5.88g柠檬酸三钠二水合物,加水定容至200ML,制成柠檬酸钠溶液。取14mL柠檬酸溶液与186ML柠檬酸钠溶液混合,混匀。B3.3.2氯化钠溶液(3mo1/L):称取17.55g氯化钠,加水定容至100mL,摇匀。B3.3.3氢氧化钠溶液(10Mol/L):称取40g氢氧化钠,溶解于少量水中,转移至100ml容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀。B3.3.4三氯乙酸溶液(PH4.0):称取500g三氯乙酸,加227Ml水,充分溶解,取30ml,加水定容至100ML,用氢氧化钠溶液调节PH至4.0。B3.3.5乙二胺四乙酸二钠溶液(0.5mo1/L):称取18.61g乙二胺四乙酸二钠,加80mL水,充分搅拌,加热溶解,待冷却至室温,加水定容至100mL。8T/SHAAV0222024B3.3.6盐酸溶液(4MO1/L):取36mL浓盐酸注入50mL水中,转移至100ML容量瓶中,加水定容至刻度,混匀。B3.3.7丙烯酰胺单体贮备液:称取14.55g丙烯酰胺、0.45gN-N'-亚甲基双丙烯酰胺,加40ML水溶解,搅拌,直至溶液变澄清透明,加水稀释至50mL,过滤。该贮备液在4℃下棕色瓶中可保存一个月。B3.3.8浓缩胶缓冲液贮备液(1MO1/L,PH6.8):称取6.06g三羟甲基氨基甲烷,加40Ml水溶解,用盐酸溶液调节PH至6.8,加水定容至50ML。B3.3.9分离胶缓冲液贮备液(1.5mol/L,PH8.8):称取9.08g三羟甲基氨基甲烷,加40mL水溶解,用盐酸溶液调节PH至8.8,加水定容至50ML。B3.3.10过硫酸铵溶液(100g/L):称取100Mg过硫酸铵,加lmL水溶解,临用现配。B3.3.11十二烷基磺酸钠溶液(100g/L):称取1.00g十二烷基磺酸钠,加10mL水溶解。B3.3.12样品缓冲液(0.08mol/L):精确称取20ng溴酚蓝,加25ml水溶解。分别量取8ml浓缩胶缓冲液贮备液、20mL十二烷基磺酸钠溶液、6mLβ-巯基乙醇、11ML丙三醇,混匀。加水定容至l0omL。B3.3.135x电极缓冲液:称取15.10g三羟甲基氨基甲烷、94.00g甘氨酸和5.00g十二烷基磺酸钠,加水定容至1000mL,临用前用水稀释5倍使用。B3.3.14考马斯亮蓝染色液(2.5g/L):称取0.25g考马斯亮蓝R-250和10.00g硫酸铵,加入20ML乙醇、10ML磷酸,溶解混匀,加水定容至100ML。B3.3.15脱色液:分别量取50ml冰醋酸、250mL甲醇、200mL水,混匀。B.4分析步骤B.4.1试样制备称取样品120mg(精密至1mg),加30ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH6.6)及3mLEDTA-2Na溶液,磁力搅拌4h至完全溶解。加15ml氯化钠溶液,磁力搅拌30min,用氢氧化钠溶液调节PH至11.8。离心60min(>18000r/Min),弃清液,加1mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH6.6)溶解沉淀30min,充分振荡,转移至2ML离心管,加1mL三氯乙酸(PH4.0),充分振荡,离心10min(>18000r/min),弃清液,加1ML丙酮洗涤,离心5min(>18000r/min),弃清液。重复丙酮洗涤一次,置通风柜内自然挥发至干。加入100L样品缓冲液,充分吹洗溶解,沸水煮1min,5000r/min离心1Min,备用。B.4.2分离胶制备按表B.1配制15%分离胶20ml,混匀后加入长、短玻璃板间的缝隙内,约60mm~