3.1细胞培养是动物细胞工程的基础（教学课件）-高二生物（浙科版2019选择性必修3）

第一节体液调节是通过化学信号实现的调节第一节体液调节是通过化学信号实现的调节第三章动物细胞工程依据植物细胞的全能性原理，能够在细胞水平上克隆植物，培育植物新品种。那么，能利用动物细胞培养技术克隆出动物个体吗？如果将不同种动物的细胞融合，能够培育出具有新性状的动物个体吗？轰动世界的克隆羊“多莉”是如何培育出来的？通过“试管婴儿”技术孕育出新生儿与一般的生殖过程有什么不同？本章将会揭示这些问题的答案。动物细胞工程常用的技术手段包括动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等。第一节体液调节是通过化学信号实现的调节第一节体液调节是通过化学信号实现的调节第三章动物细胞工程第二节神经系统通过下丘脑控制内分泌系统第二节神经系统通过下丘脑控制内分泌系统第一节细胞培养是动物细胞工程的基础目

录动物细胞的适宜条件动物细胞培养的过程动物细胞培养的特点、应用动物细胞工程常用的技术手段包括动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等。其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。那么，动物体细胞在体外进行培养需要什么条件？培养过程如何？

动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。动物体组织单个细胞细胞生长和增殖取出分散适宜条件（1）相关组织：

一般是指动物胚胎或幼龄动物的组织，

因为这些组织或细胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养。（2）适宜的培养条件：

不同的细胞、组织适合生存的环境不同，需要配置不同的培养基。一、动物体细胞可在体外适宜条件下进行培养1.动物细胞培养的概念2.原理：细胞增殖3．动物细胞培养的适宜条件（需要更复杂的培养基和更严格的无菌条件？）

(1)温度：大多数情况下，细胞生长的最适宜温度是37℃，温差一般不超过±0.5℃。达40

℃以上，细胞很快死亡。（CO2培养箱可以提供适宜的温度和控制稳定的PH环境，模拟体内生长环境。）一、动物体细胞可在体外适宜条件下进行培养体外培养的细胞失去了对整体的依赖性。体内使细胞各方面都处于最佳状态。(2)pH：大多数细胞适宜的pH为7.2～7.4，偏离此范围对细胞产生有害影响。造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2，可通过给培养箱提供恒定的5%的CO2浓度，使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态，调节pH的相对稳定。(3)95%的空气可以保证细胞呼吸对氧气的需要。(4)无菌、无毒

的条件①培养材料、培养基、培养环境、操作过程严格控制无菌。②动物细胞培养液中常含有在高温条件下变性失去功能的物质，如血清等，因而对培养液的这些成分采用过滤除菌。（无菌）

③在培养基中加入抗生素能抑制细菌和真菌的生长，从而预防污染。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素等。（无菌）④为防止细胞代谢产生的有毒物质危害细胞，应定期更换培养液。（无毒）

3．动物细胞的生长和增殖需要充足的营养物质。

培养动物细胞的培养基通常为液体培养基。(1)基本成分：水、无机盐、氨基酸、维生素、糖类、生长因子等。(2)按培养基来源分类：根据细胞生存所需的物质种类和含量严格配置而成的培养基动物血清：含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质，可以补充合成培养基中缺乏的物质主要来自动物体液或动物组织分离提取液，成分复杂，来源受限实际培养时，在合成培养基中添加一定比例的动物血清动物细胞培养最好选择固体培养基还是液体培养基？合成培养基：天然培养基：液体培养基思考：幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？【答案】细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养；分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以分化程度低的细胞更容易培养。a、无菌、无毒：

（加抗生素抑菌，定期更换培养液，清除代谢废物保证无毒）b、营养物质和激素：

（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等）c、适宜的温度和pH：

（37±0.5℃，PH7.2---7.4）d、气体环境：

O2和CO2（95%空气和5%CO2

），加入CO2是为了维持培养液中的PH值，加入O2是为了保证细胞的需氧呼吸，放入CO2

培养箱归纳动物细胞培养是所需要的条件：(3)动物细胞培养时,二氧化碳培养箱内应含有5%的CO2和95%的空气,而非5%的CO2和95%的O2。(1)动物细胞培养所用的通常是液体培养基,其并非完全的合成培养基,因为还添加了动物血清等天然成分。(2)在动物细胞培养过程中,应该对培养液和培养用具进行灭菌而非消毒。胰蛋白酶或机械处理剪碎动物胚胎或幼龄动物的组织、器官单个细胞悬浮液放在培养瓶中培养分瓶培养原代培养传代培养1.过程：贴壁生长接触抑制二、动物细胞培养包括原代培养和传代培养动物组织块先剪碎再用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液原代培养原代培养：细胞或组织离开机体后的首次培养2.原代培养：若直接培养组织块，只有处于周边的少量细胞可以生存和繁殖，大部分中间细胞因不能获得穿透能力有限的营养物质而代谢不良。（1）为什么要分散成单个细胞培养？注：胰酶的作用：酶解、消化组织中的胶原蛋白纤维和细胞外的其他成分，获得单个细胞悬液，使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需氧气和营养的供应，保证细胞内代谢产物的及时排出。思考：能不能用胃蛋白酶代替胰酶（胰蛋白酶）？3.体外培养的细胞生长特点（1）细胞贴壁：在培养瓶

悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于贴附。培养皿培养瓶所有的动物细胞都会贴壁生长吗？

来源于血液、淋巴组织细胞以及某些肿瘤细胞不需要贴附在支持物上，而是呈悬浮生长状态。瓶壁上的细胞层数是：一层（或单层）贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。（2）接触抑制分瓶培养解除方法癌变细胞没有接触抑制现象，可以在培养瓶中形成多层细胞是否接触抑制可作为区分正常细胞与癌细胞的标志之一动物细胞培养的过程动物组织块用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液原代培养问题细胞分裂受阻悬浮生长贴壁生长密度过大、有害代谢物积累和营养物质缺乏等接触抑制解决传代培养分瓶原代培养：细胞或组织离开机体后的首次培养将原培养瓶内的细胞分离并稀释后转移到多个培养瓶中，在的培养基中进行传代培养。4.传代培养:（分瓶培养）在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。用胰蛋白酶两次处理：第一次处理的目的是使组织细胞分散开；第二次处理的目的是使细胞从瓶壁上脱离下来，便于分瓶后继续培养。（每一次传代培养都需要用到胰酶）4.传代培养（分瓶培养）（1）需要传代培养的原因：①解除接触抑制②密度过大、有害代谢物积累和营养缺乏定期更换培养液，以便清除代谢物（2）操作：将原培养瓶内的细胞分离并稀释后转到多个培养瓶中，在新的培养基中进行传代培养。（分瓶培养后）（继代培养？）（3）要求：一般来说，原代培养的贴壁细胞达到生长基质的80%表面面积后可进行传代培养。若传代过晚，可影响下一代细胞的动能状态。贴壁生长的细胞需经酶（胰蛋白酶或胶原蛋白酶）消化制成细胞悬液后才能传代。原代培养视频演示传代培养视频演示比较项目植物组织培养动物细胞培养理论基础培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的获得细胞或

细胞分泌蛋白细胞的全能性细胞株、细胞系植物体快速繁殖、培育无病毒植株等葡萄糖、

动物血清蔗糖、

植物激素液体培养基（半）固体培养基细胞增殖植物细胞和动物细胞培养的比较动物细胞培养时，培养细胞能否无限制存活下去？原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。能连续培养下去的称连续细胞系或无限细胞系。不能连续培养下去的细胞称有限细胞系。5．细胞系连续细胞系(无限细胞系)：能连续培养下去的细胞系。其被认为是发生转化了的细胞系(遗传物质发生改变，突变且具有癌性细胞的特点)，有的连续细胞系是恶性细胞系，有的连续细胞系虽已获得了不死性，但保留接触抑制现象，不致癌，是良性无限细胞系。如人的成纤维细胞可传30～50代，相当于150～300个细胞周期。传代次数与细胞周期的关系如何？如何获得纯的细胞系？细胞克隆：将一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之成为一个新的细胞群体的技术。

细胞株特点：一般具有恒定的染色体组型、病毒敏感性或抗性及其他生化特性6.细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞。细胞克隆（1）最基本要求：来源于单个细胞，不能是多个细胞。（2）特点：经克隆后的细胞群基因型一致，遗传性状均一，是研究遗传规律和生理特性的重要材料。异质性细胞系

克隆培养

纯系（克隆）

单抗细胞株等具备特殊性状的细胞株都是应用克隆培养法建立的。细胞株细胞系经过进一步的克隆培养得到的。与细胞系关系：细胞系是泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。细胞系所有细胞都能传代培养，却不一定具有相同的特征，不能称为细胞克隆；而细胞株是具有特殊性质的细胞系，一个细胞株就是一个细胞克隆。（细胞系是原代培养物经传代培养得到的一群不均一的细胞）（异质性）（细胞株强调细胞培养物中细胞成分单一性，所有遗传、生化等特性完全相同，是克隆的结果。）连续细胞株：可连续多次传代的细胞株有限细胞株：可传代次数有限的细胞株细胞株

连续细胞系有限细胞系：不能连续培养。由二倍体细胞传代培养建成；有接触抑制特点：是发生转化了的细胞系，大多数具有异倍体核型。恶性细胞系：具有异体致瘤性良性细胞系：虽获得不死性，但保留接触抑制现象，不致癌。含义：能连续培养下去的细胞系分类细胞株连续细胞株：可连续多次传代的细胞株有限细胞株：可传代次数有限的细胞株细胞系细胞系是泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。(1)应用：细胞全能性的揭示、细胞周期调节控制的分析、癌变机理和衰老原因、抗癌药物的筛选、有毒物的检测等研究，都与细胞培养技术密不可分。7.动物细胞培养的应用与意义(2)意义：皮肤细胞的培养用于烧伤患者的皮肤移植，其他器官的细胞培养用于相关损伤组织器官的修复等。借助于某些细胞的大规模培养获得细胞代谢产物，如获得动物疫苗、干扰素、单克隆抗体等有重要价值的生物制品，是动物细胞培养的重要应用之一。“人造牛肉汉堡”动物性食品的获得。思考：在用胰蛋白酶酶解组织块时，由于胰蛋白酶比较温和，一定不会对细胞造成损伤吗？【答案】使用胰蛋白酶消化处理组织块时，要控制好作用时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，会对细胞造成损伤。A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行

B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离

C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理

D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化

（2021·1月浙江选考）下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是（）C(1)过程②表示_______________。(2)过程③和⑥表示用___________