翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书

罗氏(Roche)公司Tunel 试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL〔TdT-mediateddUTPnickendlabeling〕细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂状况。其原理是荧光素〔fluorescein〕dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶〔HRP，horse-radishperoxidase〕HRP〔DAB〕反响产生很强的颜色反响〔呈深棕色〕，特异准确地定位正在凋亡的DNA3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本〔石蜡包埋、冰冻和超薄切片〕和细胞样本〔细胞涂片〕在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂〔塑料饭盒与纱布〕、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：号〔蓝盖〕EnzymeSolution酶溶液：TdT10×、号〔紫盖〕LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、号〔棕瓶〕Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇〔100、95、90、80、70%〕、DAB工作液〔临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS〕、ProteinaseK工作液〔10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8〕或细胞通透液〔0.1%TritonX-1000.1%柠檬酸钠，临用前配制〕、DNase3000U/m–3U/mlin50mMTris-HCpH7.，等。三、试验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反响液→加converter-POD→与底物DAB反响显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤〔石蜡包埋切片的检测〕：25min；〔100、95、90、80、70%〕13min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.ProteinaseK15-30min21–37°C〔温度、时间、浓度均需摸索〕假设凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的ProteinaseK〔400μg/mL〕5分钟。其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际状况可承受下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均一样：1:8-10min〔通透液：0.1%TritonX-1000.1%柠檬酸钠，需颖配制〕替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中0.01NHCl〕3:200ml0.1M的柠檬酸缓冲液PH6的塑料盒中，350W〔低档〕5min。5.PBS2次；制备TUNEL反响混合液：50μl1号液+450μl2号液混匀；50μl2

号液，100μlDNase115~25℃×10min，后面步骤同处理组。50μlTUNEL反响混合液〔50μl2号液〕37℃×1h。PBS3次；可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞〔激发光波长为515~565nm〕；37℃×30min。PBS3次；50~100μlDAB15~25℃×10min；PBS3次；拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后马上用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透亮、中性树胶封片。PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观看凋亡细胞〔共计200~500个细胞〕并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合推断〔未染色细胞变小，胞膜完整但消灭发泡现象，晚期消灭凋亡小体，贴壁细胞消灭邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体〕对于培育细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，枯燥后在去离子水中漂洗，4℃保存；约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然枯燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；4%25min；④PBS5min；0.2%的TritonX-1005min；⑥PBS5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6-15四、留意事项进展PBS5min。PBSPBS溶液后再进展下一步反响。在载玻片上的样本上加上试验用反响液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进展，这样可以使反响液均匀分布于样本整体，又可以防止反响液枯燥造成试验失败。TUNEL反响液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不行使用，需重配制。PH4.0〕染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进展洗净〔100%乙醇〕、脱水〔二甲苯〕透亮、封片后通过光学显微镜观看80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较简洁脱色，留意快速进展脱水操作。7.2号液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，留意防护。试剂保存；未翻开的试剂盒贮存在-20℃〔-15~25℃〕；3号液6m内稳定，避开再次冻存；TUNEL反响液临用前配好后，放至冰上直至使用。/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡DNADNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵现象现象可能缘由TdT酶的浓度过高非特异性 TdT酶反响时间过长或TdT酶反响过程中反响液染色 渗漏，细胞或组织外表不能保持潮湿。〔建议TdTdilutionbuffer*1︰2—1︰10稀释很好地掩盖样品。尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂成分阻挡TdT进入胞内反响，进而产生假阴性结果。标记率低很高

会导致样本DNA的断裂〕在固定组织时样本DNA已断裂〔内源核酸酶的作用〕使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液固定后某些核酸酶活性照旧较高导致DNA断裂〔由于丧失〕荧光淬灭过低支原体污染TdT酶的浓度过高或反响时间过长

固定承受推举的固定液dUTPdAPT的溶液封闭用溶于PBSPH7.44%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。聚甲醛固定10分钟就会严峻淬灭，需留意避光操作12、增加通透剂的作用温度〔15-25℃〕〔如：400ug/ml5min〕4、0.1M7030min。原体污染1︰2—1︰10稀释或留意掌握反响时间红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严峻干扰。宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。DNA脱落

1、冷冻切片使用3u/ml的DNaseIDNas