酶的化学修饰

关于酶的化学修饰一、为什么要对酶进行化学修饰

虽然酶催化化学反应有专一性强、效率高、条件温和等优点，但也有一些严重的缺点，正是这些缺点使得酶的应用受到很大的限制，酶的用途还不够广泛，大规模使用酶的工业生产还很少。第2页,共53页，星期六，2024年，5月酶应用的缺点a.稳定性：酶是由细胞产生的生物活性大分子，一旦离开细胞这个特殊的环境，常常显得不够稳定，容易变性失活。b.催化反应时的条件：一般酶反应是在pH基本接近中性，温度接近室温的水溶液中进行的。但在工业应用上，由于底物和产物带来的影响，反应时的pH常常不在中性范围内。温度升高有利于提高反应速度，但酶失活也加快。当底物不溶于水时，酶难以发挥作用。第3页,共53页，星期六，2024年，5月酶应用的缺点c.酶的主要动力学性质不适应：米氏常数(Km)值过大时，反应不能在低底物浓度下高速进行。由于人体内各种代谢物质的浓度通常较低，Km值过大的酶用于临床检测和治疗时，往往不能得到良好的效果。有些底物或产物对酶活性有抑制作用，也会影响酶反应的速度。第4页,共53页，星期六，2024年，5月酶应用的缺点d.临床应用的特殊要求：当前临床应用的大多数酶来自动物、植物和微生物，对人体来说这些酶都是外源蛋白质，它们具有抗原性，有可能引起人体的过敏反应。这不但影响临床上的连续使用，还可能导致生命危险。另外，酶进入人体后也常会因一些蛋白酶、抑制剂或抗体的作用而失去活性，特别是当酶进入人体后不能迅速到达或集中于病灶时，这种情况尤为明显。

第5页,共53页，星期六，2024年，5月酶改造的两个水平基因水平：有目的的改变基因中的核苷酸顺序，从而改变酶的氨基酸顺序，以期获得化学结构更为合理的酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。蛋白质水平：人们用化学法或酶法对已合成的酶的结构进行改造，一方面是切除部分肽链和置换某些氨基酸，另一方面是使酶分子中的某些氨基酸残基与一些化学试剂反应，加上一些特定的基团，即酶的化学修饰。由于后一方面技术较为简单，容易见效，所以这方面的工作做得最多。

第6页,共53页，星期六，2024年，5月二、酶化学修饰的基本原理1．提高酶的热稳定性高度有序的天然构象是酶表现活性的必要条件，天然构象是在酶分子内各种次级键（氢键、离子键、范德华力）的作用下维持的。当温度升高时，有些次级键遭到了破坏，原先平衡的力失去了平衡，导致分子的构象发生变化，并可能产生一些新的次级键，形成有序度降低的新构象，使酶变性失活。通过酶与化学修饰剂的反应，有可能使酶的天然构象产生“刚性”，不易发生变化，同时减少分子内基团的热振动，从而增强了酶的热稳定性。

第7页,共53页，星期六，2024年，5月酶化学修饰的基本原理2．抗抑制剂酶活性抑制剂是通过直接结合于酶的活性部位来阻止酶与底物的结合，或是结合于酶的其它部位后，影响了酶活性部位将底物转变成产物。因此，阻止抑制剂与酶的结合是防止酶活性被抑制的关键。酶经过化学修饰交联上大分子修饰剂后，大分子修饰剂产生的空间障碍或静电斥力就可能有效地阻挡抑制剂与酶的结合，使酶抗抑制剂的能力增强。

第8页,共53页，星期六，2024年，5月酶化学修饰的基本原理3．抗蛋白水解酶

酶分子的基本结构是蛋白质，所以易受蛋白酶的攻击而遭破坏。蛋白酶一般是作用于某些特定氨基酸残基之间的酰胺键，修饰这些氨基酸残基，可以阻止蛋白酶对这些酰胺键的攻击。另外，交联于酶分子上的大分子修饰剂能产生空间障碍，阻止蛋白酶接近攻击点，起到“遮盖”敏感键的作用。第9页,共53页，星期六，2024年，5月酶化学修饰的基本原理4．降低酶的抗原性酶分子中有些氨基酸残基组成了抗原决定簇，当外源蛋白进入人体后就会诱发产生抗体，抗原抗体反应不仅会使酶失活，而且会对人体造成伤害和危险。通过化学修饰，有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏了抗原决定簇的结构，使酶分子的抗原性降低甚至消除。大分子修饰剂也有“遮盖”抗原决定簇和阻止抗原抗体结合的作用。

第10页,共53页，星期六，2024年，5月酶化学修饰的基本原理5．稳定酶的微环境由于酶分子各基团的极性和带电荷的不同，以及各基团间相互作用的结果，使酶分子的局部形成了一种微环境。这种微环境可以是极性的，也可以是非极性的，但都直接影响着酶活性部位氨基酸残基的电离状态，酶微环境的改变会对酶的催化功能产生直接的影响。酶经过化学修饰后，除能稳定酶的构象外，还由于大分子修饰剂本身就是多聚电荷体，可在酶分子表面形成一层“缓冲外壳”，在一定程度上保护酶的微环境，使酶能在更广泛的条件下发挥作用。

第11页,共53页，星期六，2024年，5月三、酶化学修饰方法的设计

酶化学修饰的基本原则都是充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经过一定的活化过程后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应。

第12页,共53页，星期六，2024年，5月设计酶化学修饰方法时的注意事项a.对修饰剂的要求

在选择修饰剂时一般要求修饰剂有较大的分子量，良好的生物相容性和水溶性，修饰剂分子表面有较多的反应活性基团，与氨基酸残基形成的共价键稳定，容易鉴定。b.对酶性质的了解应了解被修饰酶的活性部位情况，活性部位由哪些氨基酸残基组成。酶的稳定条件，酶反应的最适条件，有哪些侧链基团可供修饰，及这些基团的化学性质和反应活泼性等。第13页,共53页，星期六，2024年，5月设计酶化学修饰方法时的注意事项c.修饰反应条件的选择

修饰反应一般总是尽可能在酶稳定的条件下进行，尽量少破坏酶活性功能的必需基团，得到高的修饰率和高的酶活回收率。应做无修饰剂的对照。因此，选择反应条件时要注意酶与修饰剂分子的比例，反应体系的溶剂性质、盐浓度和pH，反应温度和反应时间。修饰反应的最适条件一般要经大量的试验才能确定。

第14页,共53页，星期六，2024年，5月四、修饰剂及修饰反应1．糖及糖的衍生物

（1）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯右旋糖酐是由α-葡萄糖通过α-1,6-糖苷键形成的高分子多糖，具有较好的水溶性和生物相容性，可用作代血浆。右旋糖酐硫酸酯是右旋糖酐分子中的羟基与硫酸成酯而得。多糖链上的双羟基结构经活化后可与酶分子上的自由氨基结合。双羟基的活化除溴化氰法外，还有高碘酸氧化法。高碘酸能通过氧化邻双羟基结构而将葡萄糖环打开，形成的高活性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶共价结合。

第15页,共53页，星期六，2024年，5月高碘酸氧化法

由于反应产物A不稳定，所以用四氢硼钠还原成稳定产物B。用四氢硼钠还原的反应比较激烈，对酶活性影响较大，因此可在酶与右旋糖酐之间加一个手臂来减少酶的失活，如加一个联苯胺。第16页,共53页，星期六，2024年，5月糖及糖的衍生物（2）糖肽糖肽一般是通过纤维蛋白酶降解人纤维蛋白或蛋白酶降解γ－球蛋白而得。由于糖肽结构上含有氨基，所以经活化后能与酶分子上的氨基反应而产生共价结合。第17页,共53页，星期六，2024年，5月糖肽修饰方法a.

异氰酸法：糖肽在低温条件下用2,3-异氰酸甲苯活化，再在碱性条件下与酶交联。

第18页,共53页，星期六，2024年，5月糖肽修饰方法b.戊二醛法：用双功能试剂戊二醛将糖肽的氨基活化，然后与酶分子上的氨基反应生成修饰酶。

第19页,共53页，星期六，2024年，5月糖及糖的衍生物（3）SephadexG-25可用高碘酸氧化法修饰。

第20页,共53页，星期六，2024年，5月2．聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）

PEG[HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH]和MPEG[CH3-O-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH，单甲氧基聚乙二醇]是线性分子，具有较好的生物相容性。PEG在体内不残留，无毒性和抗原性，它的末端羟基经活化后可与酶反应，产生交联。PEG修饰酶的主要优点是能消除酶的抗原性。

第21页,共53页，星期六，2024年，5月聚乙二醇修饰方法（1）三氯均嗪法

三氯均嗪环上的氯原子很活泼。当环上的一个氯原子被取代后，能够稳定其它的碳氯键（第一个氯原子在4℃就能反应，第二个氯原子在25℃反应，第三个氯原子则要到80℃才能反应）。三氯均嗪活化PEG形成修饰酶的反应如下。第一步反应后，通过石油醚抽提或减压蒸馏得到活化的PEG。

第22页,共53页，星期六，2024年，5月聚乙二醇修饰方法（2）琥珀酸酐法常用α,β-二溴代琥珀酸酐作为PEG的活化剂。活化反应在温和的碱性条件下进行，产物与酶分子上的氨基产生交联反应。也可用α,β-二碘代琥珀酸酐作为活化剂。

第23页,共53页，星期六，2024年，5月聚乙二醇修饰方法（3）重氮法重氮化反应是将修饰剂上的有关基团转变为重氮基团，然后在弱碱性条件下与酶分子上的酚基、咪唑基等反应，生成修饰酶。有多种试剂可用于这个方法，它们都是和PEG末端的羟基结合后，在酸性条件下用亚硝酸与其游离氨基反应，生成重氮基团。第24页,共53页，星期六，2024年，5月N-羧氨基苯甲酐为修饰剂第25页,共53页，星期六，2024年，5月酶修饰程度与抗原性

在多数情况下，酶的抗原性随着分子表面的自由氨基被PEG修饰而降低，当酶分子上50％以上的自由氨基参与修饰反应后，酶就几乎失去了抗原性。但是酶活性也常常随着被修饰的自由氨基数的增加而下降。

第26页,共53页，星期六，2024年，5月PEG修饰酶的酶活回收率酶被修饰氨基数（％）酶活回收率（％）腺苷脱氨酶5928精氨酸酶5365过氧化氢酶4095谷氨酰胺酶7112胰蛋白酶2495苯丙氨酸解氨酶5215尿酸酶5829L-天冬酰胺酶797第27页,共53页，星期六，2024年，5月3．合成大分子多聚物

目前用于酶化学修饰的合成大分子主要是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸等，这里仅介绍聚乙烯吡咯烷酮（poly[N-vinylpyrrolidone]，PVP）作为修饰剂的反应。常用分子量为10000的PVP作为修饰剂，在修饰反应时，首先水解打开整个PVP分子的约5％的γ-内酰胺环，生成活化的PVP后与酶反应，得到修饰酶。第28页,共53页，星期六，2024年，5月PVP修饰法第29页,共53页，星期六，2024年，5月4．肝素

肝素是蛋白聚糖中的一种成分，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸（葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸）组成，还含有硫酸酯，平均分子量20000左右。肝素不仅与其它大分子修饰剂一样，与酶共价交联后能增加酶的稳定性，同时由于肝素在生物体内还具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，因此，更适于用来修饰溶解血栓酶类以增加疗效。修饰反应的方法有碳二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法等。

第30页,共53页，星期六，2024年，5月肝素的碳二亚胺法修饰第31页,共53页，星期六，2024年，5月5．血浆蛋白质

血浆蛋白质是血浆中的天然组分，它们与外源蛋白质（包括酶）的复合物在血液中有可能被视为“自体蛋白”而被接受，同时由于血浆蛋白质具有较大的分子量，在改进酶的性质方面效果更明显。因此，已被认为是具有较大优越性和发展前途的修饰剂。其中人血清白蛋白是研究较多的一种酶修饰剂。

第32页,共53页，星期六，2024年，5月血浆蛋白质修饰法（1）戊二醛法

第33页,共53页，星期六，2024年，5月血浆蛋白质修饰法（2）活性酯法白蛋白的活性酯修饰法反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触所产生的酶失活，减少了副反应的发生。用活性酯法以白蛋白修饰尿激酶，在不用底物保护酶活性部位的条件下，酶活回收率仍高达90％以上，结合率高达80％以上。白蛋白的琥珀酰化应在碱性条件下进行，与对硝基苯酚的反应要在偏酸性pH下进行。

第34页,共53页，星期六，2024年，5月白蛋白活性酯法修饰第35页,共53页，星期六，2024年，5月6．琥珀酸酐

从大肠杆菌得到的L-天冬酰胺酶由四个亚基组成，当用琥珀酸酐在碱性条件下修饰酶的赖氨酸残基时，不同的反应条件得到了不同的结果。当酶分子中15～25％的赖氨酸被修饰后，酶活性有所提高，当40％的赖氨酸被修饰后，酶仍保留了全部活性，因此可以认为这部分基团与酶活性关系不大。随着修饰程度的增加，大量带正电荷的氨基被带负电荷的羧基侧链取代后，所产生的静电斥力就可能导致酶亚基的解离和分子内部的氨基被修饰，从而使酶活性降低。

第36页,共53页，星期六，2024年，5月L-天冬酰胺酶琥珀酰化修饰程度与酶活性的关系琥珀酸酐／LYS0.250.501.02.03.04.06.08.0琥珀酰化LYS／总LYS0.150.220.400.500.570.650.820.93酶活性／对照酶活性1.161.251.000.720.600.500.100第37页,共53页，星期六，2024年，5月7．金属离子置换

把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的功能和特性发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。通过金属离子置换修饰，可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐明酶的催化作用机制，并有可能提高酶活性，增强酶的稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。

第38页,共53页，星期六，2024年，5月金属离子置换

有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，例如α－淀粉酶中的Ca2+、谷氨酸脱氢酶中的Zn2+、过氧化氢酶中的Fe2+、超氧化物歧化酶中的Cu2+、Zn2+等。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性，有的可以使酶活性降低甚至丧失，有的却可以使酶活性提高或增加酶的稳定性。

第39页,共53页，星期六，2024年，5月金属离子置换的方法

金属离子的置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。例如，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。在离子置换修饰时，先在经过分离纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如EDTA，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，通过透析、超滤、凝胶层析等方法，将EDTA－金属离子螯合物从酶液中除去。然后将另一种金属离子加到酶液中，酶蛋白与新加入的金属离子结合，就得到经过金属离子置换的酶。

第40页,共53页，星期六，2024年，5月五、修饰酶的性质特征1．提高酶活性

有些酶通过金属离子置换后显著地提高了酶活性。如α－淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些含有镁离子和锌离子，所以一般的α－淀粉酶是杂离子型的。如果将杂离子都置换成钙离子，则可以提高酶活性3倍以上，并显著增强酶的稳定性。所以在α－淀粉酶的发酵生产、保存及应用过程中，添加一定量的钙离子，有利于提高和稳定α－淀粉酶的活性。再如，将锌型蛋白酶中的锌离子除去，置换成钙离子，其酶活性可以提高20～30%。第41页,共53页，星期六，2024年，5月修饰酶的性质特征2．提高稳定性

许多修饰剂分子上有多个活性反应基团，因此可与酶形成多点交联，固定酶的构象，增强酶的热稳定性。PEG修饰酶在热稳定性上没有明显的提高，可能是因为PEG和酶是单点交联，难以产生固定酶分子构象的效应。有些酶分子中的金属离子被置换以后，稳定性显著增强。如铁型超氧化物歧化酶（Fe-SOD）分子中的铁离子被置换成锰离子后，其对过氧化氢的稳定性显著增强，对叠氮化钠的敏感性显著降低。

第42页,共53页，星期六，2024年，5月天然酶和修饰酶热稳定性的比较

酶修饰剂

天然酶

修饰酶

温度／时间

残留酶活(%)

温度／时间

残留酶活(%)L-天冬酰胺酶聚丙氨酸50℃/7min5050℃/22min50L-天冬酰胺酶

聚乳糖60℃/10min

19

60℃/10min

63

L-天冬酰胺酶人血清白蛋白37℃/4h5037℃/40h50尿酸酶人血清白蛋白37℃/48h5037℃/48h95α-葡萄糖苷酶

人血清白蛋白55℃/3min5055℃/60min50α－淀粉酶右旋糖酐65℃/2.5min5065℃/63min50β－淀粉酶右旋糖酐60℃/5min5060℃/175min50过氧化氢酶右旋糖酐50℃/10min4050℃/10min90溶菌酶右旋糖酐100℃/30min20100℃/30min99α-糜蛋白酶右旋糖酐37℃/6h037℃/6h70β-葡萄糖苷酶

右旋糖酐60℃/40min4160℃/40min82糜蛋白酶

肝素

37℃/6h037℃/24h80第43页,共53页，星期六，2024年，5月修饰酶的性质特征3．抗各类失活因子

酶

修饰剂抗蛋白水解酶抗抑制剂抗失活剂过氧化氢酶右旋糖酐抗胰蛋白酶

核糖核酸酶右旋糖酐抗蛋白酶

溶菌酶右旋糖酐抗糜蛋白酶

抗SDS胰蛋白酶右旋糖酐抗自身水解抗大豆抑制剂抗尿素β-葡萄糖苷酶右旋糖酐

抗SDS胰蛋白酶PEG

抗大豆抑制剂

过氧化氢酶PEG抗胰酶、糜酶

L-天冬酰胺酶聚丙氨酸抗胰酶、糜酶

L-天冬酰胺酶聚乳糖抗枯草杆菌蛋白酶

胰蛋白酶PVP

抗大豆蛋白酶抑制剂

尿激酶白蛋白抗胃蛋白酶抗胎盘抑制剂尿酸酶白蛋白抗胰酶α-葡萄糖苷酶白蛋白抗胰酶

第44页,共53页，星期六，2024年，5月修饰酶的性质特征4．减弱和消除抗原性有些修饰剂在消除酶抗原性上并无作用。如PVP修饰酶在重复用于体内后，会诱导机体产生抗体使酶失活。糖类物质也不容易消除酶的抗原性，这类修饰酶在体内仍可诱发过敏反应。PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果明显。

第45页,共53页，星期六，2024年，5月乙酸酐和MPEG1修饰L-天冬酰胺酶的抗原性项目天然酶乙酰修饰酶MPEG1（5000）修饰酶（Ⅰ）MPEG1（5000）修饰酶（Ⅱ）-NH

2修饰率029.1±0.7156.0±0.9071.7±0.65酶活性10015.1±0.4025.0±0.3017.2±0.43抗原-抗体结合能力10080.2±2.3068.5±2.4126.6±1.51第46页,共53页，星期六，2024年，5月修饰酶的性质特征5．延长体内半寿期许多酶经过化学修饰后，由于增强了抗蛋白水解酶、抗抑制剂和抗失活因子的能力以及热稳定性提高，体内半寿期都比天然酶延长，这对提高药用酶的疗效具有很重要的意义。

第47页,共53页，星期六，2024年，5月修饰酶的性质特征6．对组织的分布能力（1）α-葡萄糖苷酶

Pme