过氧亚硝基传感检测的荧光探针合成与应用

背景介绍过氧亚硝基阴离子（ONOO-）是生物体内许多病理过程的信号分子之一。在生理条件下，ONOO-的有效浓度一般维持在极低的水平，且寿命也极短，通常为10ms左右。小分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、生物兼容性好等优点，将其与荧光成像技术相结合，用于活细胞、活体中目标分子的识别、影像以及监控目标分子动态变化，设计合成可特异性识别ONOO-的小分子荧光探针，并结合生物成像技术挖掘荧光探针在体内ONOO-检测与监测依然是研究的热点。文章亮点1.提供了一种基于硼酸酯为识别基团的小分子荧光探针TPE-BCO的合成方法，并考察了TPE-BCO用于体外ONOO-检测的可行性及检测条件；2.通过核磁共振氢谱、高分辨质谱表征了TPE-BCO的结构，研究了TPE-BCO的光谱性质，探讨了TPE-BCO用于ONOO-检测的响应机理；3.为用于ONOO-检测的小分子荧光探针合成及其在ONOO-检测中的应用提供了新思路。内容介绍1

实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

实验方法1.2.1

TPE-BCO的合成在25mL的单口烧瓶中加入34.8mg（0.1mmol）1-（4-羟基苯）-1,2,2-三苯乙烯（TPE-OH）、34.8mg（1.45mmol）氢化钠（NaH）以及5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），25

℃充分搅拌反应0.5h，随后加入35.5mg（0.12mmol）4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，继续反应24h。将滤液在室温下旋蒸至无溶剂，置于真空中干燥，得到除去溶剂的粗产品。用硅胶柱层析法（V（石油醚）∶V（CH2Cl2）=5∶2）分离纯化粗产品，旋蒸后得到0.0274g纯的探针TPE-BCO，产率78.4%。具体合成路线如图1所示。1.2.2

溶液的配制ONOO-溶液的配制[32]：分别取1.5mL（0.7mol/L）H2O2溶液和1.5mL（0.6mol/L）HCl溶液于烧瓶中，快速混入3.0mL（0.6mol/L）NaNO2溶液和3.0mL（1.5mol/L）NaOH溶液，在室温下快速搅拌得到ONOO-溶液。2

结果与讨论2.1

TPE-BCO的紫外-可见吸收光谱通过扫描获得了1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO的吸收光谱以及加入1.4×10-5

mol/L

ONOO-后的吸收光谱（图2）。2.2

TPE-BCO的荧光光谱TPE-BCO的荧光激发光谱和发射光谱图如图3所示。为了便于比较，实验同时扫描了TPE-OH的荧光光谱图。2.3

TPE-BCO在PBS缓冲溶液中的稳定性研究以330nm为激发波长，考察了

1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO在磷酸缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）中的稳定性（图4）。2.4

TPE-BCO用于ONOO-检测的可行性研究2.4.1

响应时间实验以1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO与

1.4×10-5mol/L

ONOO-在不同响应时间的荧光强度（λ=465nm）变化探讨了反应时间对ONOO-检测荧光强度信号的影响（图5）。2.4.2

pH的影响pH是影响荧光强度的重要参数之一，实验考察了pH4.0～10.0

的PBS缓冲溶液（0.01mol/L）中

1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO与

1.4×10-5mol/L

的ONOO-的响应情况（图6）。2.4.3

ONOO-的响应情况2.4.4

选择性2.5

反应体系检测ONOO-机理推测硼酸酯对过氧亚硝基等氧化自由基有良好的响应能力[33]。实验发现，TPE-BCO与前驱体TPE-OH的荧光光谱基本重叠，但硼酸酯作为过氧亚硝基识别基团的引入降低了TPE-BCO的溶解度，增强了TPE-BCO的荧光强度。3

结论本文设计合成了以1-（4-羟基苯）-1,2,2-三苯乙烯为荧光部分，4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯为识别部分的荧光探针TPE-BCO，并对其与ONOO-的响应性能进行了研究。该探针最大发射波长为465nm，ONOO-对TPE-BCO的荧光有猝灭响应，TPE-BCO的荧光强度与0~7.0×10-5

mol/L

ONOO-的浓度符合指数函数关系（R2

=0.9949），在ONOO-浓度7.0×10-6~2.8×10-5

mol/L的范围内呈现良好的线性相关关系，T