无菌检验技术-无菌检查用培养基制备（药品生物检定课件）

无菌检验技术

无菌检查概述知识点1无菌检查原理无菌检查原理1无菌检查原理1.1无菌检查法概念无菌检查法是指检查《中国药典》要求应无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他要求无菌的品种是否染有活菌的一种方法（供试品符合无菌检查法的规定，仅进表明了供试品在该检查条件下未发现被微生物污染）。为了保证药品的卫生质量，保证药品在临床上的安全使用和保障人民的健康，《中国药典》规定：注射用药、灭菌的外用制剂等均需做无菌检查。1.2无菌检查的一般方法无菌检查需用最严格的无菌操作法将被检查的药品或材料的样本分别接种于适合各种微生物生长的不同培养基中，于不同的适宜温度下培养一定的时间，逐日观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴性对照试验的结果，判断供试品是否被微生物污染，从而判断供试品是否合格。无菌检査法一般包括薄膜过滤法和直接接种法。前者适用于有抗菌作用或大容量的供试品如抗生素青霉素钠注射液和5%葡萄糖注射液(500ml)，后者适用于小容量非抗菌作用的供试品如维生素B12注射液(1ml)。无菌检查原理1.3无菌检查的范围凡进入人体无菌部位(人体的血液循环系统、肌肉、皮下组织)或接触创伤、溃疡面等部位而发生作用的制品或要求无菌的材料、无菌器具均应进行无菌检查。对于规定灭菌的药物，包括注射剂及用于体腔、严重烧伤、溃疡及眼科用药等，必须严格无菌，即在规定检验量的供检品中不得检出活微生物。需要进行无菌检查的品种包括药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他要求无菌的品种。主要包括以下几类。无菌检查原理(1)注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末和注射用浓溶液)，包括：用于肌内皮下和静脉的各种针剂。(2)植入剂，指将药物与辅料制成供植入体内的无菌固体制剂，即用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、避孕药物、免疫药物及抗肿瘤药物等要求无菌的制剂。心脏瓣膜以及固定金属板和有机器材等。(3)冲洗剂，即用于冲洗开放性伤口或腔体的冲洗剂。(4)眼用制剂。(5)用于烧伤、创伤或溃疡的制剂。包括：用于烧伤或严重创伤的局部用散剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂；用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂和喷雾剂等。无菌检查原理(6)用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂或洗耳剂。(7)用于手术或创伤的鼻用制剂。(8)用于止血并可被组织吸收的制剂。如明胶发泡剂、凝血酶等，用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。(9)要求无菌的医疗器械，包括外科用敷料、器材。如外科手术刀片、输血(输液)袋、博士伦等。(10)其他要求无菌的产品。无菌检查原理1.4无菌检查的环境要求无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查用洁净室(区)环境的稳定性，为确保检査结果的可靠性，对洁净室(区)的环境质量采取合理的控制措施和评价是必要的。无菌检查应在环境洁净度B级和局部洁净度A级的单向流空气区域內或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按现行国家标准进行洁净度验证。无菌检查原理1.5无菌检查一般步骤(1)玻璃仪器的洗涤、干燥、包扎、灭菌。(2)培养基的制备及适应性检查(3)无菌检查环境的测定。(4)菌悬液的制备。(5)检查方法验证。(6)样品的无菌检查。(7)报告检查结果。无菌检查原理无菌检验技术

无菌检验用培养基制备知识点2无菌检查用培养基种类及要求无菌检查用培养基种类及要求2.无菌检查用培养基种类及要求2.1培养基的种类无菌检查常用的培养基为硫乙醇酸盐流体培养基(需氧菌、厌氧菌培养基)和改良马丁培养基(真菌培养基)等。2.2培养基的配制培养基按配方称取、溶解后，调节pH(比规定的pH略高0.2～0.4)，分装，

装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。培养基必须防潮、避光、阴凉处(2～25℃)保存，配制好的培养基应在3周内使用。若保存于密闭容器内，一般可在1年内使用。无菌检查用培养基种类及要求2.3培养基的配制实例目前，药厂、药检所或科研机构一般使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基也就是按所需培养基的量称取脱水培养基，加水溶解，分装、灭菌即可。以欲检查的维生素B12为例，因是小容量非抗菌注射液，常采用直接接种法做无菌检查，应配制硫乙醇酸盐流体培养基500ml，分装12ml,15管；15ml,20管。改良马丁培养基250ml，分装9ml,10管;10ml,15管。115℃灭菌30min，备用：以检查青霉素注射剂为例，因是革兰氏阳性菌抗生素，常采用薄膜过滤法做无菌检查,应配制硫乙醇酸盐流体培养基800ml。改良马丁培养基700ml,115℃灭菌30min备用。无菌检查用培养基种类及要求2.4培养基的适用性检查为确保检查结果的准确性，配制好的每批培养基需进行适用性检查(包括培养基的无菌性检查和灵敏度检查)。培养基的无菌性检查可在供试品的无菌检查前或与供品的无菌检查同时进行，但是，一旦所用培养基不符合无菌要求，供试品的无菌检查结果应视为无效。无菌检查用培养基种类及要求2.4.1培养基的无菌性检查每批培养基随机取不少于5支(瓶)，按规定温度(细菌培养基需在30-35℃

真菌培养基需在23-28℃)培养14天，应无菌生长。如有菌生长，应重新配制

养基。

2.4.2培养基的灵敏度检查培养基灵敏度检查是指加人的各代表性菌种在培养基中均生长。无菌检验技术

无菌检查用培养基制备技能点1硫乙醇酸盐培养基制备操作规程1.硫乙醇酸盐培养基制备操作规程1.1目的：建立液体硫乙醇酸盐培养基配制使用操作规程。1.2范围：本操作规程适用于液体硫乙醇酸盐培养基的配制使用。1.3职责：质检室质检员负责本操作规程的执行，质保室质监员负责本操作规程的监督检查。1.4仪器与试剂：1.4.1仪器JY2002电子天平、85-数显恒温磁力搅拌器、LDZX-50FA立式压力蒸汽灭菌器、电冰箱、250ml三角瓶、500ml量筒、线绳、试管、棉塞。1.4.2试剂纯化水、液体硫乙醇酸盐培养基、75%酒精。

硫乙醇酸盐培养基制备操作规程1.5操作步骤1.5.1使用JY2002电子天平称取液体硫乙醇酸盐培养基7.25克，于250ml三角瓶内，加入250ml新沸的冷却水，溶解后，将培养基分装入试管中，塞好棉塞，包好牛皮纸扎紧试管口。1.5.2置LDZX-50FA立式压力蒸汽灭菌器内，于115℃高压灭菌30分钟，灭菌后，可直接加样或取出放置至室温后，放入冰箱，备用（冰箱温度控制在1～4℃）。1.5.3使用前培养基氧化层（粉红色层）的高度不得超过培养基深度的1/5，否则需经100℃水浴加热到粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，再使用。硫乙醇酸盐培养基制备操作规程1.5操作步骤1.5.4使用时，用75%乙醇擦瓶子外围，打开包扎的牛皮纸和棉塞，加入样品，完毕后，立即包好试管口，用线绳扎好，放入三菱瓦斯厌氧培养盒，再放入培养箱中培养。硫乙醇酸盐培养基制备操作规程1.6注意事项1.6.1要用新沸放冷的水配，记得沸的时间长一点。1.6.2分装的时候要边搅拌边分装。1.6.3灭菌好后使用前发现红色层过多（超过整个层高的1/5)，可在沸水浴中加热一次（仅一次，时间不得过20分钟）。硫乙醇酸盐培养基制备操作规程1.7参考文献1.7.1

85-2数显恒温磁力搅拌器操作规程1.7.2

LDZX-50FA立式压力蒸汽灭菌器操作规程1.7.3JY2002电子天平校准规程1.7.4

303-0B电热恒温培养箱操作规程硫乙醇酸盐培养基制备操作规程无菌检验技术

无菌检查用培养基制备技能点2无菌检查用培养基灵敏度检查规程2.无菌检查用培养基灵敏度检查规程2.1目的：为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行，建立无菌检查用培养基灵敏度检查规程。2.2范围：本规程适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。2.3职责：质检室质检员负责本操作规程的执行，质保室质监员负责本操作规程的监督检查。2.4内容：2.4.1试验设备及用具：无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。

无菌检查用培养基灵敏度检查规程2.4.2使用的菌株：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003铜绿假单胞菌CMCC(B)10104枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501生孢梭菌CMCC(B)64941白色念珠菌CMCC(F)98001黑曲霉CMCC(F)98003培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。

无菌检查用培养基灵敏度检查规程2.4.3检测频率每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。2.4.4操作方法2.4.4.1对照标准培养基用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。2.4.4.2试验培养基将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。液体类的培养基直接使用。

无菌检查用培养基灵敏度检查规程2.4.4.3菌悬液的制备购买对应的商业化定量菌株。使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。目前有进口的bioball和国产的microball等。使用方便，定量精确。2.4.5培养基的生长促进实验2.4.5.1琼脂类培养基的生长促进试验每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种0.1～0.5mL的菌悬液（约10～100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%～150%范围内。无菌检查用培养基灵敏度检查规程2.4.5.2液体类培养基的生长促进实验每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种0.1～0.5mL的菌悬液（约10～100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。2.4.6培养基的生长促进和抑制特性试验2.4.6.1液体培养基的生长促进特性试验接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的最短期限。与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。无菌检查用培养