培养基配制技术（药品生物检定课件）

一、水分水是微生物细胞的重要组成部分，其含量约为70%～90%，微生物细胞中的水分常以游离水和结合水两种状态存在，且游离水含量是结合水的四倍，两者在细胞中所起的生理作用不同。结合水是指由于水与溶质或其它分子结合而不能被微生物所利用的水分，结合水不能流动，不易蒸发，不冻结，不能渗透，也不能作为溶剂，因此结合水不具有一般水的特性，常束缚于原生质的胶体体系之中，成为细胞物质的组成成分，是微生物细胞生长发育的必要条件之一。游离水是指能被微生物所利用的水，其性质与结合水相反，具有一般水的特性，能流动，能自由地出入细胞，它是微生物进行代谢活动的介质，同时还直接参与一部分生化反应。营养物质的吸收、代谢产物与能量的排出均是以水为媒介的。因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，从而有效地控制细胞内温度的变化。保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素。微生物通过水合作用和脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。微生物离开了水就不能进行生命活动。二、碳源物质凡一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养物质统称为碳源物质。由此可知，糖、醇、有机酸（包括氨基酸）、脂肪、烃类甚至二氧化碳或碳酸盐类均可以作为微生物的碳源物质。其中二氧化碳和碳酸盐是无机含碳化合物，其余均为有机含碳营养物质。碳源物质通过细胞内一系列生物化学反应，形成细胞物质、形成各种代谢产物和细胞贮藏物质，为微生物进行生命活动提供能量。糖类是最常用的碳源物质，主要有单糖、寡糖和多糖。在单糖中，几乎每种微生物都能利用葡萄糖和果糖，但对甘露糖和半乳糖的利用速度较慢，对戊糖（如木糖、阿拉伯糖）的利用不如己糖普遍。寡糖又叫低聚糖，是由二至十个相同或不同的单糖单位以α-或β-糖苷键连接而组成的。其中最主要的是双糖或三糖，双糖中的蔗糖和麦芽糖是微生物普遍能利用的碳源，三糖中棉子糖能被许多真菌利用。多糖是由十种以上单糖单位以与寡糖同样的组成原则形成的分枝或不分枝的大分子碳水化合物，包括淀粉、纤维素、半纤维素等。重要的有阿拉伯聚糖，木聚糖、葡聚糖、半乳聚糖、果聚糖和甘露聚糖、甲壳质（由N-乙酰氨基葡萄糖单位以β-1，4葡萄糖苷键相连而成）和果胶质（由半乳糖醛酸残基以α-1，4葡萄糖苷键相连而成）等。淀粉是大多数微生物均可利用的碳源，果胶、半纤维素也可被许多微生物产生的胞外酶分解。纤维素较难被微生物分解，能分解纤维素的微生物主要是霉菌，如木霉、根霉、曲霉、青霉等；在细菌和放线菌中也发现有少数能分解纤维素的菌种。工业发酵生产中所提供的碳源，大多数来自植物体，如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠、糖蜜等，其成分以碳源为主，但也包含其他营养成分。实验室中，常用于微生物培养基的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、甘油和有机酸等。三、氮源物质凡是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮素来源的营养物质均称为氮源。氮源对微生物的生长发育有着重要作用，它是构成微生物细胞中核酸和蛋白质的重要元素，也是微生物含氮代谢产物的组成元素。氮源可分为氮气、无机氮化合物和有机氮化合物，不同类型的微生物由于营养生理的差异，因此对氮源的需要有很大不同。大气中分子态氮只有固氮微生物可以利用，它们把分子态氮合成自身的氨基酸、蛋白质和核酸等。有固氮能力的微生物主要是原核微生物，一类是与高等植物共生的，称为共生固氮菌，包括与豆科植物根部细胞共生的根瘤菌、与非豆科植物（如赤杨、杨梅等）共生的放线菌弗兰克氏菌，另一类是自生固氮微生物，主要是蓝细菌和固氮细菌。无机氮源主要是硝酸盐和铵盐，绝大多数微生物可以利用无机氮源。只有铵离子才能直接进入有机分子中，硝酸盐必须先还原成NH4+离子后，才能用于生物合成。当利用无机氮化合物为唯一氮源培养微生物时，培养基有可能表现生理酸性或生理碱性。例如，以硫酸铵为氮源时，由于NH4+被吸收，SO42-残留下来，造成培养基pH值下降，故有“生理酸性盐”之称。当以硝酸钾为氮源时，由于NO3-离子被还原利用，会使培养基pH值上升，故有“生理碱性盐”之称。因此，应在培养基中添加缓冲物质以稳定pH值。大多数寄生性微生物和部分腐生性微生物可以利用有机氮化合物。实验室和发酵工业生产中常用的有机氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、鱼粉、血粉、蚕蛹粉、豆饼粉等。蛋白质一般不是微生物的良好的有机氮源，但某些微生物可以通过自身分泌的胞外蛋白水解酶将蛋白质降解后加以利用，因此含蛋白质的有机氮源称为迟效性氮源；而无机氮源或以蛋白质的各种降解产物形式存在的有机氮源则被称为速效氮源。四、无机盐类由微生物细胞成分分析可知，无机元素是微生物细胞结构物质不可或缺的成分之一，占细胞干重百分之几，也是生长发育不可缺少的营养物质，许多无机元素构成酶的活性基团或充当酶的激活剂，有些无机元素具有调节细胞的渗透压、酸碱度、氧化还原电位及能量转移等作用。因此，除了含氮无机盐可以作微生物的营养物质外，含其它的无机元素的盐类也是微生物生长所必须的营养物质。根据无机元素需要量的不同，将其分为大量元素和微量元素。凡生长所需浓度在10-3～10-4mol/L范围内的元素，称为大量元素，如P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe等。磷是核酸、磷脂、核蛋白、辅酶和高能磷酸化合物的成分，在细胞内参与物质和能量代谢过程，磷以无机磷酸根的形式被吸收。硫是胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸组成成分，也是一些辅酶的活性基，如辅酶A、生物素、硫辛酸、谷胱甘肽中也含有硫。硫以SO42-的形式被吸收，少数微生物失去了还原硫酸盐的能力，需要供给还原型的硫化物（如H2S和半胱氨酸）才能生长。镁并不参与任何其他细胞结构，只是以离子状态激活许多酶的反应（如己糖激酶）。其激活作用有时可被Mn2+代替。此外，镁离子浓度在控制核蛋白体的聚合作用起着重要的作用。钾不参与细胞结构物质的组成，但它是许多酶的激活剂，可以促进碳水化合物的代谢，也控制原生质的胶态和细胞质膜的透性。钠可能与维持渗透压有关。钙不参与微生物的细胞结构，而以离子状态存在于细胞中，控制细胞的生理状态，如调节质膜的透性，激活某些酶（如蛋白酶），对一些阳离子的毒性有拮抗作用。凡生长所需浓度在10-6～10-8mol/L范围内的元素，则称微量元素，如Mn、Zn、Cu、Cl、Co、Mo、Ni、B、W、Sn、Se等。微量元素与酶的活动密切有关，常是酶的活性基的成分，也是酶的激活剂。如铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶等的活性基的组成成分；铜是多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶的活性基；锌是乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性基；钴参与微生物B12辅酶的组成，钼参与硝酸还原酶和固氮酶的结构；锰是多种酶的激活剂，有时可以代替Mg2+起激活剂作用。过量的微量元素会起毒害作用，特别是只有某单一微量元素存在时，毒害更严重。各种微量元素之间应有恰当的比例关系。由于这些微量元素常混含在其它营养物和水中，所以培养基中一般不另行添加。五、生长因子通常微生物生长所必需、其自身又不能合成或合成量不足以满足自身生长，需要外源提供的微量有机物统称为生长因子，其中包括氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶及它们的衍生物、脂肪酸及其它膜成分。各种微生物与生长因子的关系可分以下几类：1．生长因子自养型微生物它们不需要从外界吸收任何生长因子，多数真菌、放线菌和多数细菌都属这一类。如E．coli（大肠杆菌）等。2．生长因子异养型微生物它们需要从外界吸收多种生长因子才能维持正常生长，如各种乳酸菌、动物致病菌、支原体和原生动物等。3．生长因子过量合成微生物少数微生物在其代谢活动中，能合成并分泌出大量的维生素等生长因子，可作为有关维生素的生产菌种。通常由于对某些微生物所需的生长因子不了解，因此常在培养这些微生物的培养基里加入酵母膏、牛肉膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁或其他新鲜的动植物组织浸出液等物质以满足它们对生长因子的需要。谢谢

简单扩散：简单扩散或自由扩散是营养物质通过细胞膜中的含水小孔由高浓度的胞外环境向底浓度的胞内网状的转运过程，这种扩散是非特异性的但膜上小孔的大小和形状对被渗透扩散的营养物质的分子大小有一定的选择性。简单扩散的限制因素主要是物质的脂溶性、分子大小和带电性。

简单扩散示意图促进扩散又称易化扩散、协助扩散，或帮助扩散，是指非脂溶性物质或亲水性物质,如氨基酸、糖、核苷酸和金属离子等借助细胞膜上的膜蛋白的帮助顺浓度梯度或顺电化学浓度梯度,不消耗ATP进入膜内的一种被动运输过程。其转运方式分为两种：一是载体转运；二是通道转运。

主动运输：是指物质逆浓度梯度，在载体蛋白和能量的作用下将物质运进或运出细胞膜的过程。Na+、K+和Ca2+等离子，都不能自由地通过磷脂双分子层，它们从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应所释放的能量基团移位

离子泵：

膜运输蛋白之一。也看作一类特殊的载体蛋白，能驱使特定的离子逆电化学梯度穿过质膜，同时消耗ATP形成的能源，属于主动运输。离子泵本质是受外能驱动的可逆性ATP酶。外能可以是电化学梯度能、光能等。被活化的离子泵水解ATP，与水解产物磷酸根结合后自身发生变构，从而将离子由低浓度转运到高浓度处，这样ATP的化学能转变成离子的电化学梯度能。目前已知的离子泵有多种，每种离子泵只转运专一的离子。细胞内离子泵主要有钠钾泵、钙泵和质子泵。基团移位：

是指被输送的营养物质分子在膜内经过共价修饰，以被修饰的形式进入细胞质的输送过程。由于这种输送是在磷酸基团发生移位的过程中完成的，故有称之为基团移位。因为在输送过程中消耗了磷酸烯醇式丙酮酸上的高能磷酸键的键能，所以这种输送也属于主动输送。谢谢培养基的概念

培养基是指人工配制并灭菌的，适合微生物生长繁殖或生产代谢产物的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存的混合营养基质。因此，培养基必须具备微生物所需要的碳、氮、磷、硫等大量元素及微量元素、生长因子及水等，保持一定的参透压，维持适合pH值，呈现适当的物理和无菌状态。

培养基分类：按成分划分

（1）天然培养基天然培养基含有各种天然物质，其成分及含量不确定，如蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、玉米浆、麦芽浸膏等

（2）合成培养基合成培养基是由已知化学成分的营养物质组成的。由于微生物对营养要求的不同，它可以完全由无机盐或无机盐加有机化合物组成。（3）半合成培养基由部分天然材料和部分化学药品组成的培养基称为半合成培养基。由于多数微生物均能在此类培养基上生长，配制方便，成本低廉，所以生产或实验中经常用半合成培养基。按物理状态划分

（1）液体培养基用各种材料的抽提物或化学试剂按照一定比例配成的水溶液或液体状态的营养基质叫液体培养基，微生物在液体培养基中静止生长时，需氧微生物往往可在液面形成膜、岛、环，而液体仍清晰透明；厌氧或兼性厌氧微生物生长而导致液体混浊或有沉淀。

（2）固体培养基除了用固体物料加水或营养盐构成的疏松固体培养基（如曲、固体酶制剂、酱）外，固体培养基主要是指在液体培养基中加入一定量的固化胶体物质而配制成的胨状培养基。将微生物细胞接种到固体培养基上培养，能形成一定特征的菌落或菌苔。固体培养基对于研究微生物的分离、纯化、培养、保存、鉴定等均是不可缺少的。

按用途划分

（1）.基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质而制成特殊培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。

（2）富集培养基也称营养培养基，在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。富集培养基常用于营养要求苛刻的异养微生物的培养。

（3）鉴别培养基在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。

（4）选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。配制培养基的基本原则

一、根据微生物的营养特点选择营养物质

微生物营养类型不同对营养物质的需求不同，因此依据不同微生物的营养要求配制适宜的培养基是配制培养基的基本原则之一。

自养型微生物能从简单的无机物合成自身的有机体，因此培养自养型微生物的培养基可以由简单的无机物组成。例如氧化硫硫杆菌培养基组成中，只有CO2、(NH4)2SO4、MgSO4、FeSO4、KH2PO4、CaCL2、S和水等无机物，没有加入任何有机化合物。多数藻类也是自养型微生物，它们的培养基组成也比较简单，只需要无机营养物质而不需要有机营养物质。但是培养异养型微生物的培养基需要添加无机物和有机物，而且不同类型的异养型微生物的营养要求差异很大。如培养大肠杆菌的培养基组成简单，而培养肠膜明串珠菌的培养基成分非常复杂，仅生长因子多达33种。原生动物也是异养型微生物，需要较多的营养物质，如梨形四膜虫的培养基含有10种氨基酸、7种维生素、鸟嘌呤、尿嘧啶及一些无机盐等。二、控制营养物质的浓度和比例

营养物质浓度过低不能满足微生物正常生长所需，太高则可能对微生物产生毒害，如高浓度的无机盐、重金属离子等会抑菌或杀菌。因此，营养物质合适的浓度是微生物生长发育的必要条件之一。在生产过程中，在不影响微生物的生理特性和代谢转化率的情况下，通常趋向在较高浓度下进行生产，以提高产物产量，并尽可能选育高渗透压的生产菌株。当然，培养基浓度太大会使培养基黏度增加和溶氧量降低。

营养物质之间应有适当的比例，尤其培养基中营养物质的碳氮比(C／N)在微生物培养中尤其重要。不同菌种、不同发酵产物所要求的碳氮比是不同的。菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的要求也不一样。氮源过多，则菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多，则容易形成较低的pH值；碳源不足，菌体衰老和自溶。三、控制酸碱度

各种微生物正常生长均有合适的pH值，一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境。为此，当培养基配制好后，若pH值不合适，必须加以调节。

四、控制氧化还原电位

不同微生物对氧化还原电位的要求不同，一般地，好氧型微生物氧化还原电位值大于+0.1V，最适值是+0.3～+0.4V，厌氧型微生物氧化还原电位值小于+0.1V。氧化还原电位的高低受氧气分压、pH值和微生物代谢产物的影响。通常增加通气量或加入氧化剂，可以增加氧化还原电位值，加入还原剂如抗坏血酸、硫化氢、谷胱甘肽等可降低氧化还原电位值。

五、就地取材

在大规模生产中培养基用量很大，在选用培养基原料时应就地取材，尽量地利用当地较丰富的廉价原料，设法降低成本。例如，赖氨酸生产中先选用山芋淀粉，后改为用山芋粉为碳源，这样不仅价廉，而且山芋粉中还含有生物素、镁盐等，省去了原来所加的玉米浆、硫酸镁，并使整个成本降低15％。六、灭菌处理

培养基混有环境中各种杂菌，必须对培养基灭菌才能避免外来杂菌的干扰。对培养基灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法，在121℃下维持15～30分钟即可达到灭菌目的。

在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使不耐热的糖类遭到破坏，形成氨基糖、焦糖。因此含糖培养基常在112℃下进行灭菌或过滤除菌后再与已灭菌的成分混合使用。长时间高温还引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子结合，形成难溶性复合物，因此，常在培养基中加入少量螯合剂（如EDTA）或将发生反应的物质分开灭菌后混合都可以避免产生沉淀。培养基中泡沫的存在也对灭菌极为不利，应在培养基中加入消泡剂，减少或避免泡沫的产生谢谢高氏一号培养基配方

可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCL0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH=7.4～7.6。制备流程及注意事项

1、称量和溶化按配方和培养基需用量计算并称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4·7H2O可先配成0.01g/mL的贮备液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶解的试剂中，再加热融化，最后补足水分。2、调pH用试纸测培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCL进行调节。

3、分装和加塞将配制好的培养基分装入试管内，剩余的培养基装入三角瓶中，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。4、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

5、灭菌将上述培养基放入高压灭菌锅，以121℃,0.103MPa高压蒸汽灭菌20～30min。

6、搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长1/3～1/2。

7、无菌检查将灭菌培养基放入37℃的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底，如果无菌生长即为灭菌完全。

谢谢牛肉膏蛋白胨培养基配方：

牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCL5.0g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.4～7.6。其中牛肉膏提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨提供氮源和维生素，而NaCL提供无机盐，在配制固体培养基时需要加入一定量琼脂作凝固剂，如果配制液体培养基则不用加入琼脂。制备步骤及注意事项

1.称量（假定配制1000ml培养基）

依据培养基配方及所需培养基总量，计算并准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL各自的量,放入烧杯（或钢锅）中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在称量纸上，称量后直接放人水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很容易吸湿，在称取时动作要迅速。称量时严防药品混杂，如果用同一把角匙取用不同药品时，称取一种药品后，将角匙洗净擦干，再称量另一药品，同时瓶盖也不要盖错。2.溶化

在烧杯（钢锅）中先加入所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所需水分。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，同时，不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。通常不用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。3.调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol／LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.4～7.6。反之，用1mol／LHCl进行调节。对于要求pH较精确的培养基，其pH的调节常用酸度计进行。pH调节不要过头，以避免回调而影响培养基内各物质的浓度。

4.过滤

趁热用多层纱布过滤，除去杂质，以利实验结果的观察。不影响实验结果时，可以省去过滤，本实验不需过滤。5.分装

液体培养基分装高度以试管高度的1／4左右为宜，固体培养基不超过管高的1／5，半固体培养基以试管高度的1／3为宜。分装三角瓶的虽则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜。有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染（6.加塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅胶塞、金属或高温塑料试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内面造成污染，并保证有良好的通气性能。制作棉塞时，选用大小薄厚适中的普通棉花一块，铺展在左手拇指和食指形成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，直接压入试管或三角瓶口。制成的棉塞要求不紧不松，两头光滑，试管棉塞的长度约3cm左右，塞入后，试管内部分约占2/3，管外头部占1/3左右7.包扎

试管加塞后，以10多支为一组，在棉塞外包一层牛皮纸包扎成捆（图4-8），注明培养基名称、配制日期、配制人备用。三角烧瓶加塞后，外包