控制菌及螨类检查技术（药品生物检定课件）

控制菌及螨类检查技术

控制菌检查概述知识点1控制菌检查的要求和步骤药品的控制菌检查是属于药品微生物限度检查中的内容，是检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的一种方法。药品的控制菌检查包括:大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌和白色念珠菌检查。所谓的控制菌是指针对某一类剂型而言的特定指示性微生物。适用于口服制剂的控制菌为大肠埃希菌:含生药原粉及含有豆豉、神曲发酵原粉的中成口服药物还应进行大肠菌群检查;耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂的控制菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌;阴道、尿道给药制剂的控制菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌;直肠给药制剂和其他局部给药制剂的控制菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌;含动物组织包括提取物的口服给药制剂的控制菌还包括沙门菌。

控制菌检查的要求和步骤1.检查环境要求根据《中国药典》二部附录微生物限度检查中的环境要求如下:微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。2.设备、仪器2.1无菌室2.2超净工作台2.3培养箱(30～35℃)控制菌检查的要求和步骤2.4高压蒸汽灭菌锅2.5显微镜;2.6恒温水浴(45℃士1℃)2.7离心机(500～4000r/min)2.8匀浆仪2.9365nm或366nm手提式紫外灯2.10恒温水溶2.110.45μm±0.22μm薄膜及过滤器2.12电冰箱2.13玻璃器皿:锥形瓶(250～300ml，内装玻璃珠若干;500ml;1000ml)、培养皿(直径90mm)、量简(100ml，500ml)、试管(18mm×180mm，

控制菌检查的要求和步骤28mm×198mm)及相应的硅胶塞、吸管(1ml分度0.01;10ml分度0.1)、注射器(20ml或30ml等)、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。不锈钢筒(带盖)、玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中;锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干或160℃干热灭菌2h，备用。3.人员要求试验操作人员要具备微生物学方面的知识，经过无菌试验培训。

控制菌检查的要求和步骤4.一般检查步骤药品的控制菌检查的一般步骤包括供试液的制备、增菌培养、分离培养、纯培养、革兰染色及生化试验或特定试验等。增菌培养的目的是为了抑制不需要的细菌生长，面有利于需检菌的生长，为此，不同的控制菌其增菌培养基会不同。分离培养的目的是为了分离到需检菌的单菌落，而便于做纯培养和生化试验。纯培养的目的是为了得到纯种的培养物，便于做生化试验。生化试验根据不同菌种代谢情况，如酶等的不同，而进行鉴别。

控制菌检查的要求和步骤4.1大肠埃希菌的一般检步骤增菌培养→MUG-Indole检査→分离培养→纯培养→染色镜检→生化实验（IMViC）。注:阳性对照与阴性对照同时进行。4.2铜绿假单胞菌的检查步骤増菌培养→分离培养→纯培养→革兰染色镜检→生化试验(氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验、明胶液化试验)。4.3沙门菌的检查步骤増菌培养(包括增菌和增菌培养)→分离培养→初步鉴别试验→生化试验(靛基质试验、脲酶试验、氰化钾试验、赖氨酸脱羧酶试验、动力检査)→血清凝集试验。

控制菌检查的要求和步骤4.4金黄色葡萄球菌的检查步骤增菌培养→分离培养→纯培养→革兰染色镜检→血浆凝固酶4.5破伤风梭菌的检查步骤增菌培养→分离培养→革兰染色镜检→过氧化氢酶试验4.6白色念珠菌的检查步骤增菌培养→分离培养→鉴定实验→芽管试验。5.控制菌检查的菌种及菌液制备5.1菌种

控制菌检查要进行阳性对照，其阳性对照菌种如下。菌种的选择以《中国药典》附录为准，具体如下。

控制菌检查的要求和步骤5.1.1大肠埃希菌(

Escherichia

coli)5.1.2金黄色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureu)5.1.3乙型副伤寒沙门菌(

Salmonella

paratyphi)5.1.4铜绿假单孢菌(

Pseudomonas

aeruginosa)5.1.5生孢梭菌(

Clostridium

sporogenes)5.1.6白色念珠菌(

Candida

albicans)控制菌检查的要求和步骤5.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞的新鮮培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18-24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养18-24h。用0.9％无菌氯化钠溶液制成1ml含菌数为10-100ca的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2h内使用，若保存在2～8℃可在24h内使用。

控制菌检查的要求和步骤控制菌及螨类检查技术

控制菌检查用培养基及其适用性检查知识点2培养基制备及适用性检查2培养基适用性检查培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价检验用培养基是否符合检验要求。

培养基制备及适用性检查

2.1培养基适用性检查适用范围2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。2.2微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则2.2.1不同处方培养基的替代使用不能通过培养基使用性检查试验简单确定。2.2.2.培养基适用性检查不能取代供应商或其他法定标准对培养基的有效期、保存条件、制备方法等的更严格的规定。2.2.3.如果没有特殊规定，培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可，但应采用一定措施加以检测控制，如蒸馏水应核实PH是否为5~7；采用离子交换法制备的纯化水，电阻值应不小于2MΩ等。

培养基制备及适用性检查

2.2.4尽量临用现配。培养基灭菌后在能取出的前提下，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留；固体培养基灭菌或融化后，融化状态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境2~25℃保存，但不应超过20天；固体琼脂培养基熔化再使用应不超过一次。2.2.5干粉培养基或培养基原料变质不应再用；预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化不应再用。2.3对照培养基对照培养基应通过严格的质量研究和控制，具备性能稳定、质量优异的特点。对照培养基作为一种标准试剂，应具备可靠的来源和保障。

培养基制备及适用性检查

2.4培养基适用性检查指标及常用方法2.4.1检测指标：促生长能力、指示能力、抑制能力。2.4.2常用方法：直接接种法、浇碟法、表面接种法（涂布法）。2.4.3液体培养基通常采用直接接种法测定上述3种指标，接种时应注意接种量不得超过培养基体积的10%。固体培养基采用浇碟法和表面接种法测定上述指标。采用浇碟法考察固体培养基时，为了保证取样的平行性，平行测定两皿求平均数；采用表面接种法考察固体培养基时，表面接种菌液不多于0.2ml/皿，尽量控制在0.1ml/皿，保证取样的平行性，平行测定两皿观察结果。

培养基制备及适用性检查

2.5计数培养基的适用性检查微生物限度检查中计数用培养基3种，营养琼脂、玫瑰红钠营养琼脂和酵母浸出粉葡萄糖琼脂。2.5.1计数培养基适用性检查试验菌株：

大肠埃希菌［CMCC(B)44102］金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］

枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］

白色念珠菌［CMCC(F)98001］

黑曲霉菌［CMCC(F)98003］

菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证

培养基制备及适用性检查

2.5.2实验操作2.5.2.1培养基制备按规定程序新鲜配置营养琼脂（被检培养基和对照培养基）、玫瑰红钠营养琼脂（被检培养基和对照培养基）以及酵母浸出粉葡萄糖琼脂（被检培养基和对照培养基），灭菌后备用。2.5.2.2营养琼培养基取7个无菌平皿，分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照营养琼培养基，混匀，凝固后于30~35℃倒置培养48h,计数；被检培养基同法操作。

培养基制备及适用性检查

2.5.2.3玫瑰红钠营养琼脂取5个无菌平皿，分别接种白色念球菌、黑曲霉菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照玫瑰红钠营养琼脂，混匀，凝固后倒置培养72h,计数；被检培养基同法操作。2.5.2.4酵母浸出粉葡萄糖琼脂

取3个无菌平皿，分别接种白色念球菌2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照酵母浸出粉葡萄糖琼脂，混匀，凝固后倒置培养72h,计数；被检培养基同法操作。

培养基制备及适用性检查

2.5.2.4结果判断若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。

培养基制备及适用性检查

2.6控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长能力、指示和抑制特性能力。2.6.1计数培养基适用性检查试验菌株。

大肠埃希菌［CMCC(B)44102］

金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］

铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］

乙型副伤寒沙门菌［CMCC(B)50094］

白色念珠菌［CMCC(F)98001］

枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］

菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证。

培养基制备及适用性检查

2.6.2各种培养基需要测试的能力及判断指标2.6.2.1液体培养基促生长能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。增菌培养基多为澄清液体培养基，与对照培养基比较，被检培养基中试验菌应生长良好，表现为液体培养基变浑浊。2.6.2.2固体培养基促生长能力检查：取试验菌液0.1ml（含菌数50~100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。培养基制备及适用性检查

2.6.2.3液体培养基指示能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基中试验菌应生长情况/指示剂反应等应与对照培养基一致。2.6.2.4固体培养基指示能力检查：取试验菌液0.1ml（含菌数50~100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。被检培养基上试验菌的菌落形态特征、菌落颜色及指示剂反应情况应与对照培养基一致。培养基制备及适用性检查

2.6.2.5培养基抑制能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于液体被检培养基和对照培养基，取试验菌0.1ml液（不大于100cfu）分别涂布于固体被检培养基和对照培养基，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最长培养基时间下培养。试验菌应不得生长。培养基制备及适用性检查控制菌检查及螨类检查技术

控制菌检查方法验证知识点3控制菌检查方法验证步骤3控制菌检查方法验证当建立药品的控制菌检查方法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法是用于药品的控制菌检查。若药品的组分或原检查条件发生改变可能影响检查结果时，检查方法应重新验证。验证时，各品种向下控制菌检查标准中规定的菌种进行选择，验证大肠杆菌检查法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株。

控制菌检查方法验证步骤3.1方法验证用标准菌株控制菌检查要进行阳性对照，其阳性对照菌种如下。菌种的选择以《中国药典》附录为准，具体如下。3.1.1大肠埃希菌(

Escherichia

coli)3.1.2金黄色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureu)3.1.3乙型副伤寒沙门菌(

Salmonella

paratyphi)3.1.4铜绿假单孢菌(

Pseudomonas

aeruginosa)3.1.5生孢梭菌(

Clostridium

sporogenes)3.1.6白色念珠菌(

Candida

albicans)控制菌检查方法验证步骤3.2方法验证用菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞的新鮮培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18-24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养18-24h。用0.9％无菌氯化钠溶液制成1ml含菌数为10-100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2h内使用，若保存在2～8℃可在24h内使用。控制菌检查方法验证步骤3.3方法验证用供试液的制备根据被检药品的理化特性与生物学特性，采取适宣的方法制备供试液。所用乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。供试液的制备若需用水溶加温时，温度不应超过45℃，时间不得超过30min。除另有规定外,常用的供试品制备方法如下。3.3.1一般供试品溶液的制备

3.3.1.1.液体供试品

取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。控制菌检查方法验证步骤3.3.1.2固体、半固体或黏稠液供试品

取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。3.4验证方法3.4.1试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应的控制菌检查法进行检查，当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接至增菌培养基中。控制菌检查方法验证步骤3.4.2阳性对照组：取10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，按相应的控制菌检查法进行检查3.4.3阴性对照组：取相应的稀释液替代供试品，按相应的控制菌检查法进行检查。3.5结果判断阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法或控制菌检查法进行供制品的该控制菌检查；若试验菌未检出试验菌，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。控制菌检查方法验证步骤控制菌检查及螨类检查技术

药品中大肠埃希菌检查技能点1药品中大肠埃希菌检查试验操作规程1.实训目的掌握大肠埃希菌的检查程序及注意事项。2.实训要求2.1能按照下达的任务要求，完成大肠埃希菌检查的试验设计。2.2能根据试验设计完成试验的准备及试验的具体操作。2.3能根据试验反应的结果做出正确的结论。3.实验前准备3.1仪器、设备和用具恒温培养箱（30－35℃）、生化培养箱（23－28℃）、微波炉、电磁炉、匀浆仪、恒温水浴、电热干燥箱（250－300℃）、电冰箱、366nm紫外灯、蒸汽压力灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。电子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色计。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程锥形瓶、滴管、培养皿、试管、量筒、试管及塞、吸管、载玻片、盖玻片、火柴、记号笔、酒精灯、酒精棉球或碘伏棉球。3.2培养基和试剂无菌氯化钠溶液、无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、无菌聚山梨酯80、大肠埃希菌、靛基质、接种环、结晶紫、碘液、95%乙醇、沙黄染液培养基：营养肉汤、营养琼脂、胆盐乳糖（BL）培养基、MUG培养基、EMB3.2.10.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9.0g，加水溶解至1000mL，121℃灭菌20min。3.2.2pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000mL，微温溶解，分装，过滤，灭菌。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程3.2.3无菌聚山梨酯80氯化钠溶液：取吐温801mL加0.9%氯化钠溶液至100mL，121℃灭菌20min。3.2.4靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛10.0g，加入戊醇150g，充分振摇，完全溶解后，取浓盐酸50mL徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。3.2.5沙黄染液：取沙黄0.25g，加95%的乙醇10mL，使完全溶解后，加水至100mL。3.2.6结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95%的乙醇20mL使溶解，加1%的草酸铵溶液80mL，混匀。静置#23使用，置密闭棕色瓶中储存。3.2.7碘试液：取碘化钾2.0g，加水3-5mL溶解，加入碘片1.0g，全部溶解后，加水稀释至300mL，置密闭棕色瓶中储存。

药品中大肠埃希菌检查试验操作规程

3.2.8营养肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉浸出粉3g，氯化钠5g，水1000mL取上述成分，混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，灭菌。3.2.9营养琼脂培养基的制备：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-17g蒸馏水1000mLpH7.4将除琼脂以外的各成分溶解于水中，以1moL/LNaOH溶液校正pH7.4，分装三角瓶，而后按培养基的量加入1.5%-1.7%琼脂，0.1Mpa灭菌20min后倒平板备用。3.2.10胆盐乳糖培养基（BL）：蛋白胨20g，乳糖5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾（K2HPO4）1g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.3g，牛胆盐（或去氧胆酸钠0.25g)1.3g，水1000mL,除乳糖、牛胆盐外，取上述成分，混合，加热溶解后，调节pH使灭菌后为7.2±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程

3.2.114—甲基伞形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）：蛋白胨10g，氯化钙50mg，硫酸锰0.5mg，硫酸锌0.5mg，硫酸镁0.1g，氯化钠10g，磷酸二氢钾（无水KH2PO4）0.9g，磷酸氢二钠（无水Na2HPO4），亚硫酸钠40mg，去氧胆酸钠1g，4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸75mg，水1000mL除4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸外，上述各成分溶解于1000mL水中，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，加入4—甲基伞形酮葡萄糖苷酸，溶解后，每管分装5mL，115℃，灭菌20min。3.2.12曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）：营养琼脂培养基100mL，20%乳糖溶液5mL，曙红钠指示液2mL，亚甲蓝指示液1.3—1.6mL取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液，摇匀，倾注平皿。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程3.2.13曙红钠指示液：取曙红钠2.0g，加水溶解成100mL。3.2.14亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水溶解成100mL。3.3对照用菌液的制备：取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5mL营养肉汤培养基内，置36℃±1℃，培养18～24h，取均匀培养物1mL用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1mL含菌10~100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。3.4供试液的制备：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至1000mL，用匀浆仪（3000～5000r/min2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程3.5阳性对照试验

各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10-100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的各控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再做阳性对照。3.6阴性对照试验

取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程4.检验程序药品中大肠埃希菌检查试验操作规程4.1增菌培养取胆盐乳糖（BL）培养基2份，每份各100ml。1份加入10ml供试液（相当于供试品1g、1ml、10cm2），另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18-24小时，必要时可延至48小时。阴性对照应无菌生长。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程4.2分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1-2环培养液划线于;EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18-24h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。大肠埃希菌菌落形态特征药品中大肠埃希菌检查试验操作规程培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与上表所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认大肠埃希菌。4.3纯培养如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2-3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18-24h，作以下检查。如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于EMB琼脂平板，培养18-24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程4.4革兰染色、镜检以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2-3次（载玻片不烫手）固定。滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。滴加95%乙醇，脱色20-30s，水洗。滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。染色结果判定：革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程5.注意事项5.1玻片必须洁净，无划痕。涂片的菌量宜少，菌不可浓。否则，菌细胞成堆或连成片。不利菌细胞染色反应判断及形态观察。5.2培养物的菌龄以16-24h为宜。培养时间过长，革兰阳性菌易染成红色。5.3脱色是关键。脱色时间不足，菌细胞易染成阳性；脱色时间过长，菌细胞易染成阴性。5.4可用已知革兰染色为阳性、阴性的菌种做染色的质量控制。药品中大肠埃希菌检查试验操作规程控制菌检查及螨类检查技术

药品中大肠埃希菌检查知识点4药品中大肠埃希菌检查方法4.1大肠埃希菌4.1.1大肠埃希菌即大肠杆菌为肠杆菌科埃希菌属的模式种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。4.1.2形态特征

大肠埃希菌为两端钝圆的短小直杆菌，革兰染色阴性，无芽孢，多有鞭毛，以周身鞭毛运动或不运动。许多菌株有荚膜和微荚膜。4.1.3培养持征

大肠埃希菌最适培养温度为37℃，可在15-46℃生长，最适pH是7.4-7.6，兼性厌氧。在营养肉汤培养基中,37℃培养24h，形成菌膜，管底有黏液状沉淀，培养物有粪臭味；在营养肉汤琼脂培养基中，可形成凸起、光滑、湿润、乳白色、边缘整开的菌落。药品中大肠埃希菌检查方法4.1.4生化反应

大肠埃希菌能迅速分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等多种碳水化合物，产酸产气，不分解尿素，靛基质试验阳性，甲基红试验阳性，VP试验阴性，不利用拘酸盐，不液化明胶4.1.5抵抗力

大肠埃希菌对理化因素的抵抗力，在无芽孢菌中是较强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，能过冬。加热60℃30min能被杀死。对漂白粉、酚、甲醛和戊二醛等均较敏感，水中含(0.5-1)/106氯能被杀死。大肠埃希菌对丁胺卡那及头孢菌素类较敏感，对磺胺类、链霉素、氯霉素、金霉素、四环素等产生不同程度的耐药性。药品中大肠埃希菌检查方法4.2检查程序4.2.1增菌培养

取胆盐乳糖培养基(BL)3瓶，每瓶各100ml。2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入对照菌10-100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18-24h，必要时可延至48h，阴性对照应无菌生长。4.2.2MUG-mdd快速检查分别从上述增菌培养后的胆盐乳糖增菌培养基中取0.2ml分别于装有5mlMUG培养基的试管中36℃±1℃培养，于5、24h在366nm紫外光下观察，同时，用未接种的MG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照为MUC阴性和靛基质阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判断供试品未检出大肠埃希菌。药品中大肠埃希菌检查方法4.2.3曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板划线分离如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性，均应在曙红亚甲蓝琼脂(EMB)培养基或麦康凯琼脂培养基平板划线分离。分离如下：将增菌培养后的胆盐乳糖培养液轻轻摇动，以接种环沾取1-2环培养液划线于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)培养基或麦康凯琼脂培养基平板上,36℃±1℃分离培养18-24h，观察菌落特征。大肠埃希菌菌落形态特征药品中大肠埃希菌检查方法培养基菌落形态曙红亚甲基蓝(EMB)平板呈紫黑、浅紫色、蓝紫色或，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。麦康凯琼脂(MacC)平板鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落不符，报告未检出大肠埃希菌。如有疑似大肠埃希菌的菌落则进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验，确认是否为大肠埃希菌。4.2.4纯培养

选择平板菌落典型特征相符或疑似菌的2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24h，后取营养琼脂培养基斜面的培养物进行检查。4.2.5革兰染色镜检以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述可疑菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，通过火焰2～3次干燥固定。初染：滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。媒染：滴加碘液，媒染1min，水洗。脱色：滴加95%乙醇，脱色20-30s，至流出液无色，水洗。药品中大肠埃希菌检查方法复染：滴加沙黄染液，复染1min，水洗，待干后，镜检。革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。4.2.6生化试验4.2.6.1靓基质试验(1)将纯培养物接种于蛋白胨水培养基中,37℃培养24～48h，沿管壁加入对甲氨基苯甲醛试液0.3～0.6m，观察液面是否有红色环。大肠埃希菌应有红色环，液面有红色环为阳性。4.2.6.2甲基红试验(M)将纯培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中,37℃培养24～48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，红色为阳性，黄色为阴性。大肠埃希菌应是阳性。药品中大肠埃希菌检查方法4.2.6.3乙酰甲基甲醇生成试验（VP）将纯培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养24～48h，加入VP试剂甲液1ml，混匀，再加入VP试剂乙液0.4ml，充分摇匀，观察结果，数分钟后出现红色为阳性，黄色为阴性；大肠埃希菌应是阴性。4.2.6.4枸橼酸盐利用试验(C)将纯培养物接种于枸橼酸盐琼脂培养基中,37℃养24～48h。观察结果，培养基由绿色变成蓝色为阳性，黄色为阴性。大肠埃希菌应是阴性。最后要把据靓基质试验(I)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇生成试验（VP）、枸橼酸盐利用试验(C)和革兰染色镜检结果确认。MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为-+--、革兰阴性杆菌，报告1g、1ml供试品检出大肠埃希菌。若与以上不符，报告1g、1ml供试品未检出大肠埃希菌。药品中大肠埃希菌检查方法当阴性对照有菌生长或阳性对照无菌生长或生长菌落不是大肠埃希菌，不能做出检验报告。4.3注意事项4.3.1配制MUG培养基时，务必校正pH，灭菌后pH不得超过7.4，否则pH偏高，MUG会分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。4.3.2在曙红亚甲基蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑选可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选2-3个以上菌落分别做IMViC试验鉴别，挑选菌落越多，挑选阳性菌落的机率一个菌落越高，如仅挑选IMViC试验的鉴别，则易漏检。药品中大肠埃希菌检查方法4.3.3在IMViC试验中，沾取菌苔后按C盐、I、M、Vi次序接种，勿将培养基带入C盐斜面上，以免产生阳性结果，同时培养天数改为2-4天。4.3.4阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阳性对照菌液的制备、计数及加入含供试品的培养基中的操作，不能在检测供试品的洁净试验室或净化台上进行。必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境。4.3.5检测大肠埃希菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不准抽样复检。检出的大肠埃希菌及其他控制菌培养物须保留1个月，备查。药品中大肠埃希菌检查方法控制菌检查及螨类检查技术

药品中大肠菌群检查知识点5药品中大肠菌群检查方法5.1大肠菌群大肠菌群(Coliform)是指37℃生长时能发酵乳糖，在2h内产酸产气的革兰阴性、氧化酶阴性、需氧或兼性厌氧的无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属(

Escherichia)的多数菌外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属(

Enterobacter)、枸橼酸菌属(

Citrobacter)、克雷伯菌属(Ablh)的多数菌。大肠菌群包括了正常人畜肠道内需氧的大多数革兰阴性杆菌。以大肠菌群作为卫生指示菌比控制大肠埃希菌具有广泛的卫生学意义，检查方法简便。因此，国际上以大肠菌群作为药品、食品、饮水等的卫生指示菌，对卫生质量的要求更严格。药品中大肠菌群检查方法大肠菌群细菌在水、土壤、空气中常见，它是人和动物肠道中主要的菌丛，常通过粪便和动物的活动污染水和环境，同时也带来致病污染的危险。有人用粪便污染土壤后，在不同时间(1～2个月)检查土壤中大肠埃希菌的存活情况。结果随着时间的增加，大肠埃希菌的存活率降低，而产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷菌的检出率逐渐增加。说明大多数大肠埃希菌不能适应外界环境而死亡，少部分大肠埃希菌在外界环境的影响下逐渐变成的产气肠杆菌或阴沟肠杆菌、肺炎克雷菌。由此表明：在样本中检出大肠埃希菌，表明样本受粪便的近期污染；如同时检出产气肠杆菌或阴沟肠杆菌、肺炎克雷菌，表明样本受粪便的近期污染和远期污染。大肠菌群的检查通过增菌、分离、革兰染色镜检和确证试验等步骤。药品中大肠菌群检查方法5.2检查程序5.2.1增菌培养

取不少于10m胆盐乳糖发酵培养基管3支，加入1:10供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml);1:100稀释的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)和1:1000稀释的供试液1ml(含供试品0.001g或0.001ml)。取1支胆盐乳糖发酵培养基10ml管，加入稀释剂1ml作为阴性对照。均培养18-24h，观察结果。加供试液的胆盐乳糖发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气，则判该管未检出大肠菌群。若胆盐乳糖发酵管产酸产气，则进一步分离培养。5.2.2分离培养

将上述产酸产气的发酵管中的培养物，分别划线接种于曙红亚甲基或麦康凯琼脂培养基平板上，培养18～24h。药品中大肠菌群检查方法大肠菌群的菌落在红亚甲蓝琼脂培养基平板上呈紫黑、紫红，红或粉红色，圆形，偏平或凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润：在麦康圆琼脂培养基平板上呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润，若平板上无菌落生长，或生长的菌落与上述菌落特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群：若平板上生长有上述菌落形态特征或疑似菌落，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。5.2.3确证试验

从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，接种于乳糖发酵管中，培养24-48h、若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠需群，否则判未检出大肠菌群（见下表）。药品中大肠菌群检查方法最可能的大肠菌群数药品中大肠菌群检查方法各供试品量的检出结果最可能的大肠菌群数1.0g或1.0ml0.1g或.0.1ml0.01g或0.01ml+++﹥102++-10﹤N﹤102+--1﹤N﹤10---﹤15.3注意事项5.3.1加供试液的乳糖胆盐发酵管，由于有的药渣颜色较深或沉淀物较多，干扰结果的观察。应仔细观察倒管底部或试管壁、培养液表面有无气泡。5.3.2乳糖胆盐发酵培养基内的倒管不小于30mmx3mm(内径)。否则，倒管被药渣遮挡，不便观察结果。5.3.3加供试液的乳糖胆盐发醇管，经培养后，其倒管内无论产气多少，均应做分离培养，革兰染色、镜检。如产气太少，可延长培养时间。5.3.4尽可能多挑选EMB或麦康凯琼脂培养基平板上大肠菌群可疑菌落，做乳糖发酵确证试验。挑可疑菌落越多，可提高大肠菌群检出率。药品中大肠菌群检查方法控制菌检查及螨类检查技术

药品中大肠菌群检查技能点2药品中大肠菌群检查试验操作规程1.实训目的掌握大肠菌群的检查程序及注意事项。2.实训要求2.1能按照下达的任务要求，完成大肠菌群检查的试验设计。2.2能根据试验设计完成试验的准备及试验的具体操作。2.3能根据试验反应的结果做出正确的结论。3.实验原理一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人、畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价产品的卫生质量，推断产品中有否有污染肠道致病菌的可能。药品中大肠菌群检查试验操作规程4.仪器及设备恒温培养箱、玻璃平板或一次性无菌平板、多头滤器及配套设施、滤膜（0.45μm）、镊子、高压灭菌锅、牛皮纸、棉绳、橡皮筋、冰箱

、塑料瓶、酒精灯、

三角瓶、橡皮塞、超净工作台、取样袋、75%酒精、无菌蒸馏水5.培养基和试剂5.1培养基：大肠菌群显色培养基制备：根据供应商提供的说明书，搅拌加热煮沸至完全溶解，不要高压蒸汽灭菌，不要过度加热。待培养基冷却至47±2℃，分装至平板，厚度为4mm。倒置冰箱保存。5.2氧化酶试纸5.3酵母浸膏培养基（无葡萄糖PCA）或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）药品中大肠菌群检查试验操作规程6.操作步骤:6.1过滤及培养6.1.1灼烧过滤头除菌，使用无菌镊子将滤膜贴放于已冷却的过滤头上，安装滤杯。在CCA平板上记录相关信息。6.1.2过滤前充分摇晃，混匀待测样品，将待测样品倒入滤杯中。6.1.3

使用无菌镊子小心转移滤膜至CCA培养基，无菌操作。6.1.4将平板倒置于36±2℃培养21-24小时药品中大肠菌群检查试验操作规程6.2结果判读6.2.1分别计数不同类型的菌落，根据下表对菌落进行验证：

注：NA表示不适用药品中大肠菌群检查试验操作规程CCA琼脂上的菌落类型氧化酶试验紫罗兰色菌落NA粉红色菌落√其他类型菌落NA(1)所有紫罗兰色菌落均确认为大肠埃希氏菌，不需要进行氧化酶试验。(2)部分CCA平板上可能出现蓝绿色菌落，这部分菌落不应该记录为大肠菌群或大肠杆菌。(3)对粉红色的菌落，证实试验是必须的。

6.3验证试验6.3.1氧化酶试验挑取至少10个菌落进行该试验(如果总的粉红色菌落少于10个,则应挑取全部菌落进行试验),可直接挑取CCA平板上的菌落进行氧化酶测试,但务必注意,粉红色菌落本身带有颜色,浅红色或无色均被认为是阴性结果。紫红色才被认为是阳性结果。禁止使用铁质或镍铬丝接种环。药品中大肠菌群检查试验操作规程6.4分离纯化试验6.4.1TSA划线如果由于菌落太小，或者菌落之间太近存在融合，则使用接种环小心挑取部分菌落，划线接种在TSA培养基上。倒置于36±2℃培养22±2H，然后再挑取单菌落进行氧化酶试验。7.结果报告大肠菌群的结果=（紫罗兰色的菌落数+确认为大肠菌群的粉色菌落数）/过滤体积单位报告为CFU/VmL药品中大肠菌群检查试验操作规程8.注意事项8.1乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管，若有气泡上冒，也算产气。8.2在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属光泽，则为典型菌落，98%以上为大肠菌群。药品中大肠菌群检查试验操作规程控制菌检查及螨类检查技术

药品中沙门菌检查知识点6药品中沙门菌检查方法7.1沙门菌沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌，沙门菌可通过人、畜、禽的粪便或与带菌者接触，直接或间接的污染药品原料、辅料及生产的各个环节，所以来源于动物的药物，如脏器、粪便、全虫体等污染几率较高。因此，药品微生物限度标准规定，以动物来源的药物、动物脏器制品不得检出沙门菌。7.1.1形态特征

沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，菌体端钝圆，除个别菌种外，都具有周身鞭毛，能运动，一般无荚膜，少数有包膜。7.1.2培养特征

沙门菌为需氧或兼性厌氧，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8～7.8。在鉴别培养基上，菌落细小，透明或半透明。由于一般不分解乳糖，菌落无色，产生H2S，故在胆盐硫乳(DHL)琼脂上形成黑色或中心黑色的菌落。药品中沙门菌检查方法7.1.3生化反应

沙门菌分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，产酸不产气；不分解乳糖、蔗糖：靛基质试验-：尿素酶试验-；氰化钾试验-；赖氨酸脱羧试验+；硫化氢反应+或-；动力检查+。7.1.4抵抗力

沙门菌对热、消毒药和外界不良因素的抵抗力与大肠埃希菌相似，在水中能存活数周至数月；在粪便中存活1～2个月。60℃10～20min被杀死，在5%石碳酸、0.2%升汞溶液中5min被杀死。对氯霉素、土霉素敏感。胆盐和煌绿对沙门菌的抑制作用较大肠埃希菌小得多，故可用于该菌分离。药品中沙门菌检查方法7.2检查程序供试液的制备见“药品中微生物总数的检查。阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阳性对照试验的目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阴性对照试验：取稀释剂10m1加入100m1(或200ml)相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。

阴性对照试验的目的：检查稀释剂是否满足要求及培养条件是否适宜。药品中沙门菌检查方法7.2.1增菌培养预增菌取营养肉汤培养基3份，每份200m1,1份加入10g或者10ml供试品，混匀；1份加入供试品及阳性对照菌10～10cfu，混匀；1份加入稀释剂10ml作阴性对照,30～35℃培养18～24h，观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无生长。增菌培养轻微摇动供试品增菌培养瓶，分别吸取1m接种于一管含10ml硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18～24h。7.2.2分离培养

轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别以接种环沾取1～2环培养液划线于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝琼脂(EMB)或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h，必要时延长至40～48h。检查平板有无疑似沙门菌菌落。沙门菌在上述平板上的菌落形态特征见下表。药品中沙门菌检查方法沙门菌的菌落特征药品中沙门菌检查方法平板菌落特征胆盐硫乳琼脂(DHL)无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。沙门菌志贺菌琼脂(SS)无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。曙红亚甲蓝琼脂(EMB)无色至淡橙色，半透明或不透明，光滑湿润的圆形菌落。麦康凯琼脂（MacC）无色至淡橙色，半透明或不透明，菌落中心有时为暗色。由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平版上轻为明显，在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属因多数属株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心。在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似门满菌菌落形态，须进一步鉴别。由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别。7.2.3初步鉴别试验

从每个供试品的分离平板上挑取2～3个疑似菌落(落形态特征与表10-4所列的形态特征相符或疑似)分别接种于三糖铁斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面并穿刺到底层或光穿刺底层再划线斜面，培养18～24，观察结果。药品中沙门菌检查方法疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：①斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)；②斜面红色，底层黄色；③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。将疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色，镜检。沙门菌应为革兰阴性杆菌。7.2.4生化试验7.2.4.1靛基质试验

用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠埃希旋靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。7.2.4.2脲酶试验

用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养24h观察结果。斜面变红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应。药品中沙门菌检查方法7.2.4.3氰化钾试验

将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20～-24，用接种环沾取培养液1环，接种至氰化钾培养基内，另取一环培养液接种于不含氰化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24～48h，观察结果。对照管内有菌生长(混浊)，而试验管也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长(混浊)而试验管无菌生长(清亮)为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。本试验十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴中进行，防止氰化钾分解，产生氢氰酸逸出，致使培养基内氰化钾浓度降低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氰化钾为剧毒品，操作时须谨慎，切勿用口吸液。用后的培养基，每管加数粒硫酸亚铁和20%的氢氧化钾0.5ml，去毒，然后再灭菌，洗涤。药品中沙门菌检查方法7.2.4.4氨酸脱羧酶试验

用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种1支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24～48h观察结果。对照管黄色(产酸)，试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。7.2.4.5动力试验

用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状。无动力表现的培养物，应在室温保留2～3天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力试验阳性。7.2.4.6血清凝集试验

制备1片洁净的灭菌载玻片，在近中央一端，以直径3mm接种环沾取沙门菌属O多价1血清2～3环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹，长约1.5cm，宽约0.5cm。另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴性对照。药品中沙门菌检查方法用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生，有时因血清效价低，反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个温棉球在旁边，盖上皿盖，经过约20min，再观察结果.若仍然没有出现凝集，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成浓菌液，在100℃水浴中保温30min(除去可能存在的Vi抗原)，待冷，再做凝集试验，如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应。7.2.5结果判断7.2.5.1供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属O多价1血清凝集试验阳性反应(含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阳性反应)，报告10g或10ml供试品检出沙门菌。药品中沙门菌检查方法7.2.5.2供试品培养物三糖铁琼脂反应及生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属0多价1血清凝集试验阴性反应(含待检培养物经100℃30min处理后凝集试验为阴性反应），报告10g或10m供试品未检出沙门菌。7.2.5.3供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进一步鉴定后，再作报告。①供试品培养物生化反应符合沙门菌属反应②供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属O多价1凝集试验阳性反应。7.2.6注意事项7.2.6.1试验用培养基，需经过质量鉴定，用已知典型反应菌株(如乙型副伤寒沙门菌CMCC(B)50041)进行测试，其灵敏度及特征性反应应符合要求。培养基需在规定条件保存，在规定时间内使用，分离平板使用前应置30～35元温箱内倒置孵育1～2h使其表面漏湿润，利于分离沙门菌。药品中沙门菌检查方法7.2.6.2对供试品进行测试的同时，需做阳性菌对照及阴性对照。阴性对照应无菌生长，阳性对照应显示阳性结果，否则检验结果无效，在进行阳性菌对照试验时，应与供试品检验分开操作，避免污染。特别是用种环的沾取菌液进行接种或分离时，避免动作过大，形成气溶胶，污染供试品检验用具及操作环境。7.2.6.3为保证试验方法的可靠性，对分离平板上的疑似菌落，应多选取几个菌落同时进行试验。挑取菌落时，不要在分离平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而应在菌落分部稀疏部位挑选。7.2.6.4生化试验及血清学试验的被鉴定培养物必须是纯培养物，否则，不可能得到正确结果。如遇血清学凝集试验阳性而生化试验不符合时，应首先检查培养物的纯度。对已污染的培养物，不应丢弃，因为污染菌可能掩盖沙门菌，故应对被污染的培养物进行重新分离，仔细选取单个菌落再进行试验。药品中沙门菌检查方法7.2.6.5所有生化反应均需按照规定的试验要求进行，如观察三糖铁琼脂斜面反应的时间，应在24±2h，时间过短过长，都可能出现错误结果判断。又如氯化钾试验，试管口应密塞，否则氰化钾浓度降低，使抑菌作用下降，产生错误的判定。7.2.6.6血清凝集试验的影响因素甚多，除与电解质、pH、温度有关外，需特别注意抗原与抗体用量的比例恰当，只有当二者浓度适当时，凝集反应方明显可见。由于本法试验用多价血清，其凝集力相对较弱，试验用菌液量切不能过大。测试前，应用已知阳性菌测试以掌握适宜菌液浓度。7.2.6.7沙门菌为肠道重要致病菌，操作时应特别注意防止分离待检菌及阳性对照菌对操作环境及试验的污染。所有用过的增菌、分离、生化试验培养基、血清学凝集试验及染色镜检后的玻片等，均需经灭菌后方能洗涤。药品中沙门菌检查方法控制菌检查及螨类检查技术

药品中铜绿假单胞菌检查技能点3药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程1.实训目的掌握铜绿假单胞菌的检查程序及注意事项。2.实训要求2.1能按下达的任务要求，完成铜绿假单胞菌检查的试验设计。2.2能根据试验设计完成试验的准备及试验的具体操作。2.3能根据试验反应的结果做出正确的结论。3.仪器、设备和用具恒温培养箱、生化培养箱、微波炉、电磁炉、匀浆仪、恒温水浴、电热干燥箱、电冰箱、366nm紫外灯、蒸汽压力灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。电子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色计。锥形瓶、滴管、培养皿、试管、量筒、试管及塞、吸管、载玻片、盖玻片、火柴、记号笔、酒精灯、酒精棉球或碘伏棉球。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程4.培养基和试液、指示液0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、1%盐酸二甲基对苯二胺试液、盐酸试液、氯仿、营养肉汤培养基、胆盐乳糖（BL）培养基、营养琼脂培养基、溴代十六烷基三甲胺、绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）、明胶培养基、硝酸盐胨水培养基。对照用菌液铜绿假单胞菌营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。5操作方法5.1供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.2供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）。5.3增菌培养取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照菌应无军生长。5.4分离培养轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1～2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.5纯培养供试品分离平板生长6.4所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查。5.6革兰染色镜检5.6.1革兰染色以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2-3次（载玻片不烫手）固定。5.6.2镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。5.7生化试验用铜绿假单胞菌做生化试验的阳性对照株。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.1氧化酶试验取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30s内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。本操作应注意：试验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反映不可靠。试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外）挑取菌落（苔），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯而胺氧化变色不可用。反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性范性。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.2绿脓菌素试验取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，36℃±1℃培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加氯仿3～5ml，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在氯仿液内。静置片刻，待氯仿分层，用吸管将氯仿移至另一试管中，加入盐酸试液（1mol/L）约1ml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色，即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的PDP琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1～2天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.3硝酸盐还原产气试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养24h，观察结果。如在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。5.7.442℃生长试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9%无菌氯化钠液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置42℃±1℃的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24～48h，斜面如有菌苔生长者为阳性反应；无菌苔生长为阴性反应。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程5.7.5明胶液化试验以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于36℃±1℃培养24h。取出放入0～4℃冰箱内10～30min。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应；如明胶呈凝固状，为阴性反应。本试验应注意：（1）本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。（2）试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程6结果报告6.1供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。6.2供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。6.3

凡与7.1与7.2结果不符合报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程7注意事项7.1污染铜绿假单胞菌的药物，因生产工艺和药物的影响，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形态可产生非典型形态。为防止漏检，在挑取疑似菌落时，宜取2～3个以上菌落，分别进行检验，以提高铜绿假单胞菌的检出率。7.2

绿脓菌素是铜绿假单胞菌鉴定的重要特征，但色素的产生受许多因素的影响，除菌株差异及变异外，培养条件是重要因素，温度、培养基成分等皆可影响色素产生。培养基中琼脂、蛋白胨等均应事先测试，选用适宜品牌，试验时并用阳性菌株作对照试验。药品中铜绿假单胞菌检查试验操作规程控制菌检查及螨类检查技术

药品中铜绿假单胞菌检查知识点7药品中铜绿假单胞菌检查方法7.1铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌为假单胞菌属的模式种。本菌首先从临床样本中分离所得，该菌感染使脓汁呈铜锈样的蓝绿色，故命名为铜绿假单胞菌，习称绿脓杆菌。此菌广泛分布在土壤、水及空气，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品。本菌是常见的化脓性感染菌，在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗难度，国内外药典均将铜绿假单胞菌检查列为检查项目之一。铜绿假单胞菌按增菌、分离、纯培养，革兰染色镜检及生化试验等步骤进行检验。7.1.1形态特征

铜绿假单胞菌为革兰阴性、直或微弯曲的杆菌，无芽孢，无荚膜，有1～3根的单端鞭毛，运动活泼。药品中铜绿假单胞菌检查方法7.1.2培养特征

铜绿假单胞菌除在硝酸盐培养基中以外都是专性好氧。最适生长温度为35℃，在含硝酸盐和亚硝酸盐培养基中于42℃能发育生长是本菌的特点之一。此菌营养要求不高，基本培养基生长良好，因是专性好氧菌，在培养基表面生长较旺盛，在液体深部发育不良，在条件适宜的营养肉汤培养基中生长迅速，24h液面出现菌膜，菌液表面呈现蓝绿色或黄绿色水溶性色素，本菌能产生水溶性绿脓色素与荧光素；在固体培养基上形成湿润，扁平，边缘不整齐，较大的菌落，并具有生姜味。在血平板上大多数菌株能形成溶血环。7.1.3生化反应

铜绿假单胞菌能分解葡萄糖。产酸不产气，不分解乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖。基质试验-，尿素酶+，氧化酶+，硝酸盐还原产气试验+，枸橼酸盐利用试验+，不产生H2S，液化明胶试验+。药品中铜绿假单胞菌检查方法7.1.4抵抗力

铜绿假单胞菌对热抵抗力不强，56℃30min可被杀死。在1%石炭酸、0.2%甲酚皂溶液处理5min可将其杀死。对青霉素，链霉素等不敏感，对新霉素、庆大霉素、多黏菌素B轻度或中度敏感，但易产生耐药性。本菌对十六烷三甲基溴化铵有抗性，故可用于该菌分离。此外本菌在陈旧培养物极易死亡，保存时须注意。7.2检查程序供试液的制备见“药品中微生物总数的检查。阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查，阳性对照试验应检出相应的控制菌。阳性对照试验的目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。药品中铜绿假单胞菌检查方法