抗生素效价测定技术（药品生物检定课件）

抗生素效价测定技术：抗生素效价检定概述：抗生素效价微生物检定法知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品一、抗生素效价定义抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性通常用效价单位来表示，即抗菌效价指抗生素药物的作用强度。在临床应用中，抗生素的效价可准确地反映抗生素的医疗价值，以“单位（U/IU）”表示。硫酸链霉素798单位/毫克青霉素G钠1670单位/毫克杆菌肽

74单位/毫克知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品二、抗生素效价单位抗生素效价的标示量，原则上应按所含特定的抗菌活性部分的重量来计算。在应用中，抗生素类药物有效成分的表示方法，是按照各种抗生素的特点及使用经验，采用符合客观实际的效价单位表示。常用的抗生素效价单位有质量单位、类似质量单位、质量折算单位、特定单位。知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品抗生素效价单位的表示方法一、质量单位质量单位以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（纯游离碱或游离酸）的质量1μg作为1单位，即1mg=1000单位。碱性抗生素以纯碱的量作为有效部分的量；酸性抗生素以纯酸的量作为有效部分的量。知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品二、类似质量单位

类似质量单位以特定的纯抗生素制品盐的质量1μg作为一个单位，即1mg＝1000单位，其中包括了无抗菌活性的酸根在内。这种类似质量单位，虽然并不合理，但在国际上已经习惯沿用。知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品三、质量折算单位质量折算单位是以特定的纯抗生素制品的某一质量为1单位而加以折算。

如：青霉素国际标准品

第一批青霉素国际标准品，青霉素G钠0.6微克为1单位，即1667单位/毫克。

第二批青霉素国际标准品，青霉素G钠0.5988微克为1单位，即1670单位/毫克。知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品四、特定单位特定单位是指对于不易得到纯品，组成成分较复杂的抗生素，在开始生产及临床使用时，只能以一特定量的标准品（或对照品）作为1单位。

如：杆菌肽国际标准品

第一批杆菌肽A国际标准品为55单位/毫克；

第二批杆菌肽A国际标准品为74单位/毫克。知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品五、抗生素微生物检定用标准品标准品是指用于生物检定、抗生素或生化药品中含量或效价测定的标准物质，按效价单位（或μg）计，以国际标准品进行标定。标准品分为国际标准品和国家标准品。知识点1：抗生素效价的概念及检定用标准品六、供试品供试品是供检定其效价的样品，它的活性组分应与标准品基本相同。需用各品种项下规定的溶剂溶解，再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度。

知识点3：浊度法

浊度法的测定原理

是分别加入抗生素标准品和供试品到已接种有试验菌的培养液中，因不同浓度的抗生素对试验菌的抑制作用不同，在一定时间内，通过测量培养基内试验菌浓度（浊度）变化就可确定供试品的效价。知识点3：浊度法通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法。可用于抗生素药物的含量（效价）测定。浊度法知识点3：浊度法

特点：

浊度法因在液体中进行，所以不受扩散因素的影响，不会像管碟法那样易受如钢圈的放置、向钢圈内滴液的速度、液面的高低、菌层厚薄等种种因素影响抗生素在琼脂表面扩散，而造成结果的差异或试验的失败。同时本法误差较小，管碟法的可信限率为5%，最大可达7%，而本法在1%—3%；而且可进行自动化测定，易实行规范化操作。知识点3：浊度法一、菌悬液的制备：如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌悬液二、检查用溶液的制备（一）标准品溶液的制备（二）供试品溶液的制备三、含试验菌液体培养基的制备知识点3：浊度法四、检定操作方法（一）线性试验

除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9.0ml，再分别精密加入各浓度的标准品溶液1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。知识点3：浊度法（三）空白试验

另取2支试管，各加入药品稀释剂1.0ml，再分别加入含试验菌的液体培养基9.0ml。其中一支试管立即加入甲醛溶液0.5ml，混匀，作为空白对照。另一支试管同法培养，作为细菌生长对照。知识点3：浊度法（四）吸光度的测量

在线测定各管的吸光度。或取出，立即加入%甲醛溶液(1_：3)0.5ml以终止微生物生长，在530或580nm波长处测定各管的吸光度。（五）记录与计算1．试验记录要求应包括抗生素的品种、剂型、标示量、生产厂、批号、检查目的、检验依据、检验日期、温度、湿度、标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对人、抑菌圈测量结果。知识点3：浊度法2．标准曲线的计算标准品的各浓度对数值及相对应的吸光度列成表。3．回归系数的显著性测验判断回归得到的方程是否成立，即x、y是否有直线关系，可采用t检验。4．测定结果的计算及可信限率估计。5．实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。

知识点3：浊度法6．原料药效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。7．效价结果的有效数字按《中国药典》的规定取舍小数位。知识点3：浊度法五、二剂量法或三剂量法除另有规定外，取大小一致的已灭菌的试管，在各品种项下规定的剂量反应线性范围内选择适宜的高、（中）、低浓度，分别精密加入各浓度的标准品和供试品溶液各1.0ml，二剂量的剂距为2：1或4：1，三剂量的剂距为1:0.8。比浊法剂量间的比例通常为1：1.25或更小。同标准曲线法操作，每一浓度组不少于4个试管，按随机区组分配将各试管在规定条件下培养。照生物检定统计法的规定进行可靠性测验及效价计算。知识点3：浊度法六、供试品供试品是供检定其效价的样品，它的活性组分应与标准品基本相同。需用各品种项下规定的溶剂溶解，再按估计效价或标示量稀释至与标准品相当的浓度。知识点：管碟法一、检定原理管碟法，又称杯碟法，是通过将不锈钢小管（俗称为牛津杯）放置在含敏感试验菌的琼脂培养基上，将抗生素溶液注入小钢管中，抗生素分子随溶剂向培养基内呈球面状放射状扩散。同时将培养基置入适宜试验菌生长的培养箱内，使试验菌开始生长。抗生素分子在琼脂培养基中的浓度随与小钢管间距离的增大而降低，离小钢管越远，培养基中的抗生素分子越少，相应的抗生素浓度越低。当抗生素分子扩散达到一定时间，可在小钢管周围形成一个抑菌圈。知识点：管碟法知识点：管碟法知识点：管碟法从图11-1和式(11-2)可以看出，抑菌圈的半径大小与最小抑菌浓度c、琼脂层厚度H、抗生素在琼脂内扩散系数D、抗生素在小钢管中的量M以及抗生素的扩散时间T有关。这些因素的改变会影响抑菌圈的大小和清晰度。故在抗生素效价测定时，为消除各种因素的干扰，采用标准品和供试品在相同试验条件下进行，测得相对效价的比率，再由已知标准品效价计算供试品效价。管碟法的优点是样品用量少、灵敏度高，但同时专属性较差、操作烦琐、影响因素多。知识点：管碟法知识链接

量反应平行线原理抗生素微生物检定法是基于量反应平行线原理，即“在量反应指标中，当抗生素浓度的对数剂量与反应呈直线关系，且供试品与标准品的作用性质相同时，供试品与标准品的两条量反应关系曲线相互平行”。

管碟法试验中，在一定剂量范围内，抗生素的对数剂量与其抑菌圈大小呈直线关系，抗生素标准品和供试品在产生的两条量反应直线平行，符合量反应平行线原理。知识点：管碟法图11-2抗生素量-反应直线知识点：管碟法二、检定方法（一）操作流程1.试验用菌液、缓冲液、培养基的配制2.标准品与供试品溶液的3.双碟的4.滴加药液到小钢管5.培养6.抑菌圈测量7.计算结果知识点：管碟法知识点：管碟法管碟法根据试验设计不同，可分为：1.一剂量法(标准曲线法)常用于原料生产的过程监控、中间体或半成品检验

2.二剂量法(2.2法)是抗生素质量检验的常规方法3.三剂量法(3.3法)

主要用于标准品的标定

日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果，必须使用三剂量法测定的结果仲裁。知识点：管碟法（二）操作注意事项1.试验环境实验室应防止抗生素及微生物的污染。2.仪器用具

玻璃容器应清洗、灭菌；校正后方可使用。双碟的规格应符合药典规定。3.试验菌应具备如下特点：对抗生素成分敏感，对杂质、降压物质及毒性物质无作用或作用很低；灵敏、稳定、抑菌圈边缘清晰、测定误差小；易于培养、保存，无致病性；与同品种国际通用药典所用试验菌一致，以便效价单位的统一。知识点：管碟法4.操作次序上的误差要求滴加迅速。在操作很多检品时，以分批操作为好。5.抑菌圈的测量

测量抑菌圈是管碟法的重要环节，应尽量避免主观误差的产生。技能点1：二剂量法操作规程四、二剂量法（一）效价计算公式

二剂量法是将抗生素的标准品、供试品各稀释成高、低两种剂量（4:1或2:1），在同一含试验菌的琼脂培养基平板上进行对比，根据两种剂量四种溶液所产生的抑菌圈大小，计算出供试品的效价。技能点1：二剂量法操作规程（一）效价计算公式

二剂量法供试品的效价计算：式中，T2为供试品高剂量；T1为供试品低剂量；S2为标准品高剂量；Sl为标准品低剂量；R为供试品和标准品等反应剂量的比值；I为高、低剂量间浓度比的对数（常数）；Pr为供试品的测得效价；AT为供试品的标示量。技能点1：二剂量法操作规程（二）操作方法1.检验用溶液的制备（1）标准品溶液的制备：标准品的使用与保存，应遵循标准品使用说明书的规定。（2）供试品溶液的制备：精密称取供试品，用各药品项下规定的溶剂溶解后，制成浓度一般为lOOOU/ml的浓溶液，再根据要求用缓冲液稀释至与标准品相当的滴碟所用最终高、低两个浓度，作为供试品溶液。

技能点1：二剂量法操作规程

技能点1：二剂量法操作规程2.菌悬液的制备(1)枯草芽孢杆菌悬液：取枯草芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35~37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。

(2)短小芽孢杆菌悬液：取短小芽孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。

(3)金黄色葡萄球菌悬液：取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20~22小时。临用时，用灭菌水或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

技能点1：二剂量法操作规程2.菌悬液的制备

(4)藤黄微球菌悬液：取藤黄微球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26—27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面。用培养基Ⅲ或0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

(5)大肠埃希菌[EscherichiacoliCMCC(B)44103]悬液：取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~37℃培养20~22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

技能点1：二剂量法操作规程3.双碟的制备

在半无菌室内或超净工作台上进行，应注意微生物及抗生素的污染，放双碟的台面应用水平仪调水平。玻璃/塑料平皿(d=90mmh=16-17mm)

菌层5ml含菌培养基底层20ml灭菌培养基技能点1：二剂量法操作规程制备底层制备菌层技能点1：二剂量法操作规程4.放置钢管5.滴碟、培养毛细滴管（或滴管）滴碟滴加顺序：按标准品高剂量溶液→供试品高剂量溶液→标准品低剂量溶液→供试品低剂量溶液

（即SH→TH→SL→TL）

6.测量抑菌圈

双碟透明度好，无破损和不透明现象；抑菌圈应圆满，无破圈或圈不完整现象，否则应弃去该双碟。技能点1：二剂量法操作规程技能点1：二剂量法操作规程技能点1：二剂量法操作规程

在恒温培养箱中培养至规定时间

技能点1：二剂量法操作规程测量抑制圈

技能点1：二剂量法操作规程测量仪器技能点1：二剂量法操作规程方法一方法二技能点1：二剂量法操作规程技能点1：二剂量法操作规程（三）记录与计算1.记录

试验记录应包括抗生素的品种、剂型、规格、标示量、生产厂商、批号、检验目的、检验依据、检验日期、温度、湿度、标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对人、抑菌圈测量结果。技能点1：二剂量法操作规程2.计算式中,PT为供试品效价相当于标示值或估计效价的百分数;S2为标准品高浓度所致抑菌圈直径(面积)总和;S1为标准品低浓度所致抑菌圈直径(面积)总和;T2为供试品高浓度所致抑菌圈直径(面积)总和;T1为供试品低浓度所致抑菌圈直径(面积)总和;I为高、低