食品调味料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法

1食品调味料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定液相色谱-串联质谱法本方法规定了食品调味料中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于固态调味料（调味粉、香辛料、风味汤料、固态火锅底料、固态复合调味料等）、半固态调味料（花生酱、芝麻酱、辣椒酱、番茄酱、风味酱等酱料、火锅蘸料、蚝油、半固态火锅底料、香辛料酱、半固态复合调味酱等）和液态调味料（鸡汁调味料、牛肉汁调味料、调味料酒、液态复合调味料、调味油、辣椒油、火锅汤料、鱼露、其他食用汤料）中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的定量测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品用0.2%甲酸水或盐酸溶液分散均匀，用0.2%乙腈提取后，经分散固相萃取净化，高速离心脱脂，取下清液经液相色谱-串联质谱法测定和确证，外标法定量。4仪器和设备4.1液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：电喷雾离子源（ESI）。4.2分析天平：感量为0.00001g。4.3分析天平：感量为0.01g。4.4高速冷冻离心机：转速≥10000r/min。4.5超声波清洗器：功率为800W。4.6涡旋混合器。4.7匀浆机。25试剂与材料除另有规定外，本方法中所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。5.1.3甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。5.1.4正庚烷（C7H16）：色谱纯。5.1.5环己烷（C6H12）：色谱纯。5.1.6甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.1.7盐酸（HCl）。5.1.8无水硫酸镁（MgSO4）。5.1.9氯化钠（NaCl）。5.1.10N-丙基乙二胺固相萃取填料（PSA）：粒径50μm、孔径60Å。5.1.11十八烷基键合硅胶吸附剂（C18粒径范围为40μm～60μm。5.2试剂配制5.2.1盐酸溶液（0.1mol/L）：量取盐酸（5.1.7）9mL，加水至1000mL，摇匀备用。5.2.2甲酸乙腈溶液（0.1%）：量取甲酸（5.1.6）1mL，用乙腈（5.1.1）稀释至1000mL，摇匀，过滤备用。5.2.3含0.1%甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液：量取甲酸（5.1.6）1mL，称取甲酸铵（5.1.3）0.63g（精确至0.01g），加少量水溶解后，定容至1000mL，混匀后过滤。5.2.4正庚烷-环己烷溶液(2:8,V/V)：量取正庚烷（5.1.4）20mL，以环己烷（5.1.5）定容至100mL，摇匀备用。5.3标准品5.3.1罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因标准品：纯度大于98%。中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子量详见表1。表1标准品基本信息C20H21NO457-27-2C17H19NO3NoscapineC22H23NO73表1（续）英文名称C18H21NO3C19H21NO35.4标准溶液配制5.4.1标准储备液（1.0mg/mL）：分别精密称取罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因标准品各10mg（精确至0.01mg）至小烧杯中，加少量0.1%甲酸乙腈溶液（5.2.2）溶解溶液定量移入10mL容量瓶中，用0.1%甲酸乙腈溶液（5.2.2）稀释至刻度，摇匀，配制成浓度均为1.0mg/mL的标准储备液。此溶液密封后﹣18℃避光保存，有效期1年。5.4.2混合标准储备液：准确吸取罂粟碱、那可丁、蒂巴因标准储备液（5.4.1）各100µL和吗啡、可待因标准储备液（5.4.1）各500mL于100mL容量瓶中，0.1%甲酸乙腈（5.2.2）定容，摇匀，即得含罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0µg/mL和吗啡、可待因浓度为5.0µg/mL的混合标准品溶液。密封后4℃避光保存，有效期6个月。5.4.3标准工作溶液：分别准确吸取混合标准储备液（5.4.2）10µL、20µL、40µL、100µL、200µL、400µL于10mL容量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，得罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL，40ng/mL吗啡、可待因浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的系列标准工作溶液，现配现用。5.5微孔滤膜：孔径为0.22µm有机相型微孔滤膜。6试样制备和保存6.1取所有待测液体样品（＞50g），置玻璃烧杯中，搅匀。取所有待测半固体样品（＞50g），置玻璃烧杯中，匀浆混匀。取所有待测固体样品（＞50g），置粉碎机中粉碎混匀。6.2混匀好的样品分成两份，分别作为试样（＞20g）和留样（＞20g），装于洁净聚四氟乙烯离心管中，密封并标记，于﹣18℃保存。7试样处理7.1称取2g试样（精确至0.01g）于50mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加5mL的0.2%甲酸水溶7.2取上述离心上清液5mL，置于10mL或50mL四氟乙烯具塞离心管中，加2mL正庚烷-环己烷(2:8,V/V)，加无水硫酸镁、PSA、C18(3:1:1)混合粉末0.25g，振荡后涡旋混合1min，以10000r/min冷冻离心5min，去除上层，移取乙腈层，经0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，待UPLC-MS/MS测定。7.3空白基质制备：根据配制标准工作曲线的使用量，称取适量空白基质样品，按上述步骤处理，用于配制标准工作溶液。8测定48.1参考液相色谱条件8.1.1色谱柱：WatersUPLCHSST3(1.7μm,2.1mm×100mm)，或性能相当者。8.1.2进样量：2µL。8.1.3柱温：40℃。8.1.4流速：0.3mL/min。8.1.5流动相：A相：含0.1%甲酸的10mmol/L甲酸铵溶液（5.2.3），B相：0.1%甲酸-乙腈溶液（5.2.2），按表2进行梯度洗脱。表2梯度洗脱程序8.2参考质谱条件8.2.1离子化方式：电喷雾电离。8.2.2扫描方式：正离子扫描。8.2.3检测方式：多反应监测（MRM）。8.3定性测定在相同实验条件下测定标准溶液和样品溶液，若样品溶液中检出色谱峰的保留时间与相应标准溶液色谱峰的保留时间一致，且样品溶液的质谱离子对相对丰度与浓度相当标准溶液的质谱离子对相对丰度相比较，相对离子丰度（k）的相对偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在该组分。表3定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差k＞505±20±25±30±508.4定量测定8.4.1取标准工作溶液进样，以罂粟碱、那可丁和蒂巴因的色谱峰面积为纵坐标，罂粟碱、那可丁和蒂巴因的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，外标法定量。8.4.2在上述色谱和质谱条件下，5种化合物的标准物质提取离子（定量）质谱图参见附录B。8.5空白试验除不加试样外，均按上述步骤进行。9结果计算样品中吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可丁的含量按如下式计算：X—试样中各待测物的含量，单位为微克每千克(µg/kgc—由标准曲线中得出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLV—样液的提取体积，此处为10，单位为毫升（mLm—试样的质量，单位为克（g以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。10方法精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。11方法检出限和定量限0.6µg/kg；定量限分别为9.0µg/kg、9.0µg/kg、1.8µg/kg、1.8µg/kg、1.8µg/kg。12方法准确度本方法吗啡、可待因在0.5~500µg/kg添加浓度范围内，回收率为65%~110%。罂粟碱、那可丁、蒂巴因在0.1~100µg/kg添加浓度范围内，回收率为65%~120%。6A（资料性附录）参考质谱条件A.1参考质谱条件5