实验一-DNA提取资料

实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。2实验原理细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例：RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4mol/LNaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。关于植物总DNA的提取主要有两种方法：1．CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。2．SDS法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate,简称SDS）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（meltingtemperature,Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。3材料和试剂：3.1长春花叶片3.2试剂（1）CTAB提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2%CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。表1CTAB提取缓冲液配制

用HCl调pH值。（2）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA（pH8.0）。（3）氯仿/异戊醇：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。4仪器设备离心机、3离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、电子天平、高压灭菌锅、一次性手套、电泳仪等。

5方法与步骤：5.1在提取过程中用到的吸头，提取缓冲液等先高压灭菌（121℃，20min），取出后待用；

5.2取大约指甲盖大小的植物叶片，放入1.5ml的EP管中,加入液氮，用钢珠研磨成粉末状，再加入600μL的CTAB提取缓冲液，；5.365℃水浴锅中水浴40min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻轻混匀，颠倒几次，乳化1min。4℃，11,000rpm离心10min；5.4吸上清到新离心管中（约400μl），加入等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃放置20min沉淀DNA；

5.55000rpm常温离心15min，倒掉上清液；

5.6用75%乙醇（900μl）洗沉淀，11,000rpm离心2min，倒掉乙醇，再用乙醇同样处理一次；5.7置于干燥仪干燥10min，将水分蒸干；5.8加入50μL去离子水，融解DNA，同时加