GBT 43158-2023 马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法（正式版）

马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofDickeyasolani2023-09-07发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草原则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、广州海关技术中心。1马铃薯黑胫病菌检疫鉴定方法1范围本文件描述了马铃薯黑胫病菌的检测和鉴定方法。本文件适用于进出境种球和块茎等植物繁殖材料中马铃薯黑胫病菌的检测、分离和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文本必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4马铃薯黑胫病菌基本信息中文名称：马铃薯黑胫病菌分类地位：细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、溶果胶菌科/果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌属(Dickeya)。马铃薯黑胫病菌的相关信息见附录A。5方法原理根据病害症状、菌落形态特征、自动微生物鉴定仪(Biolog)测试结果、烟草过敏性反应、致病性测试以及聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)仪检测结果等进行病菌的分离、检测和鉴定。6仪器设备和主要试剂6.1仪器设备及试剂6.1.1超净工作台。6.1.2培养箱。6.1.3恒温孵育仪。26.1.5Biolog仪。6.1.7实时荧光PCR仪。6.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。7检测流程病菌的分离、鉴定等检测流程如图1所示，检测步骤可分步或同时进行。有症样品有症样品病菌分离疑似分离物PCR检测致病性测试Bioloy测试烟草过敏性反应马铃薯黑胫病菌马铃薯黑胫病菌阴性8检测鉴定8.1症状检查8.2病菌分离图1检测流程图和SN/T2122的规定取样，观察样品上是否有变色和腐烂症状(见附录A)。取症状样品病健交界处组织0.1g～0.2g,使用70%酒精表面消毒30s,灭菌水洗3次后转入离心管中，加入1mL灭菌水，浸泡15min,按照附录B规定制作培养基，取浸出液在营养琼脂培养基(NutritionAgarmedium,NA)平板上划线分离；也可将浸出液稀释10倍、100倍和1000倍后分别取100μL涂布NA平板，置于28℃下培养2d～3d后挑取疑似菌落，纯化3次后用于后续试验。典型菌3图2NA培养基上的菌落分离物提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA),按照附录C的规定进行常规PCR检测或按照附录D的规定进行实时荧光PCR检测，阳性分离物进行后续测试，包括Biolog测试、致病性测试和烟草过敏性反应测试等。分离物在NA上培养24h后转移至按照附录B要求制作的BUG培养基上，置于30℃下培养24h,按照Biolog使用说明，调整菌悬液浊度加入GENⅢ微孔板中，每孔100μL。30℃下培养18h后8.5致病性测试分离物在NA上28℃培养24h后用灭菌水配成10⁸CFU/mL的菌悬液，针刺接种风信子和马铃后观察发病情况。风信子接种症状如图3所示，风信子叶片上病斑呈水渍状，病健交界清晰，后期变色软腐；马铃薯接种症状如图4所示，马铃薯茎干迅速变褐，软腐，并伴有恶臭。如出现上述症状，则从发病组织处分离其中病菌，PCR检测分离物，根据检测结果判断接种分离菌和接种物是否是同种细菌，完成致病性测试。4图4马铃薯上的接种症状(左侧2株：Dickeyasolani;右侧2株：无菌水)8.6烟草过敏性反应(可选)分离物在NA上28℃培养24h后用灭菌水配成10⁸CFU/mL的菌悬液，用灭菌注射器针头注入普通烟草叶片背面表皮下，以灭菌水作为对照，28℃光照培养24h～48h,观察烟草是否出现过敏性反应。9结果判定分离物的菌落形态特征与目标菌相符，常规PCR或实时荧光PCR检测为阳性，且致病性测试为阳性，判定为马铃薯黑胫病菌Dickeyasolani。必要时(实验室首次截获、新寄主、新分布地等),增加Biolog测试和烟草过敏性反应，Biolog测试为Dickeyasolani,能引起烟草过敏性反应，判定为马铃薯黑胫病菌Dickeyasolani。10记录和材料保存10.1试验记录10.2样品保存样品置于阴凉干燥处或冰箱中保存6个月。阳性样品至少保存1年，以备复检、谈判和仲裁，样品保存期满后，应经高温灭菌后处理。10.3菌株保存阳性分离物用30%甘油制成菌悬液，置于一80℃下保存1年；或冻干后于—20℃下保存。5(资料性)病菌基本信息A.1名称及分类地位中文名：马铃薯黑胫病菌分类地位：细菌界(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、溶果胶菌科/果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌属(Dickeya)。A.2地理分布A.3寄主马铃薯(Solanumtuberosum)和风信子(Hyacinthusorientalis)。A.4传播途径病菌主要通过球茎、块茎、花卉、观赏植物等繁殖材料的调运进行远距离传播。田间传播主要是通过土壤、雨水和灌溉水，病菌由伤口或皮孔侵入后感染发病。A.5生物学特征NA培养基上菌落圆形，扁平，边缘略呈波纹状，乳白色至浅黄色，不透明或略透明，表面有轻微褶皱，48h后菌落呈典型煎鸡蛋状，菌体杆状，能动，大小0.9μm×2.0μm,生物3型，产生磷酸酶和吲哚，可利用D-阿拉伯糖、D-蜜二糖、D-棉籽糖、甘露醇，革兰氏阴性，金氏B(King’sBmedium,KB)和NA培养基上39℃可生长。A.6症状病菌主要侵染茎基部和薯块，在马铃薯生长期的各个阶段均可发病。病菌主要通过带病的种薯传播，由伤口或茎皮孔侵入组织后发病，导致地下部块茎腐烂与地上部植株茎腐及叶片枯死，如图A.1和图A.1马铃薯幼茎上腐烂症状图A.2风信子种球上腐烂症状6病重的块茎播种后，种薯不发芽，或刚发芽就烂在土中，不能出苗；有的幼苗出土后病害发展至茎部，很快死亡，常造成成苗率低。早期病株萎蔫枯死，常不能结薯。发病较轻或晚的植株，只有部分枝叶发病，病症不明显。病株结的块茎，病菌从匍匐茎进入块茎，受侵染的块茎组织表面颗粒状凹凸不平，质地软化，呈乳白色至棕褐色。腐烂组织边缘呈褐色至黑色，病健组织分界明显，而后扩展致整个块茎腐烂，最后只剩薄薄的外皮。病株的叶片多先从上部叶片发病向下部叶片扩展。发病初期，叶缘变枯干涸，逐渐延及至整个叶片，严重时全株枯死。维管束组织自茎基部开始变褐，逐渐延至上部，最终导致茎基部中空坏死。7(规范性)培养基的制作要求蒸馏水100调整pH至7.4,121℃湿热灭菌15min。B.2BUG琼脂培养基(BUGagarmedium)BUG琼脂培养基57.0g蒸馏水1000mL调整pH至7.4,121℃湿热灭菌15min。B.3金氏B培养基(King'sBmedium,KB)蒸馏水100调整pH至7.2～7.4,121℃湿热灭菌15min。8(规范性)C.1引物引物为Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3')/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3'),源于鞭毛蛋白编码(flagellin-C.2反应体系PCR反应体系25μL,包括2.5μL10×PCR缓冲液buffer(Mg²+plus),2.5μL脱氧核糖核苷三磷上下游引物(引物浓度各为5μmol/L),1μL模板DNA,1.5UTaq聚合酶(5U/μL),加水至25μL。也可使用等效的PCR预混液配制反应体系。以灭菌去离子水作空白对照，以D.solani的DNA作为阳性对照，以同属其他种(如D.chrysanthemi或D.dadantii)DNA作为阴性对照。C.3反应条件(温度/时间)PCR反应程序：94℃3min;94℃30s,65℃30s,72℃30s,循环35次；最后72℃10min。C.4结果判定PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶1×Tris乙酸盐乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)缓冲液(Trisacetate-EDTAbuffer,TAE)电泳，溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)或核酸染料染色后用凝胶成像系统分析。阳性对照、阴性对照和空白对照均正常，分离物出现与阳性对照大小一致的491bp扩增产物，判定为阳性，无预期扩增产物或产物大小不一致判定为阴性。9(规范性)实时荧光PCRD.1引物及探针引物Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3')/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3'),探针P-Ds(5'-FAM-ct-tcagcggtatttaccag-MGB-3'),源于flic基因序列D.2反应体系反应总体积为20μL,包括：实时荧光反应混合液TaqManMasterMix10μL,10mol/L的上下游引物各1μL,10mol/L的探针1μL,DNA模板1μL。也可使用等效的实时荧光PCR预混液配制反应体系。以灭菌去离子水作空白对照，以D.solani的DNA作为阳性对照，以同属其他种的DNA作为阴性对照。D.3反应条件(温度/时间)PCR反应程序：95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环。D.4结果判定阳性对照、阴性对照和空白对照均正常：——疑似分离物出现典型扩增曲线判定为阳性；无典型扩增曲线判定为阴性。——检测样品，出现典型扩增曲线，循环数阈(CycleThreshold,Ct)值情况可分为：Ct≤35时，判定为阳性；35<Ct<40,增加DNA增加用量至2μL～5μL再次测试，出现典型扩增曲线，且Ct≤35,判定为阳性；其余情况判定为阴性。GB/T43158—2023[1]StawiakM,LojkowskaE,VanderWolfJM.FirstreportofbacterialsoftrotonpotatocausedbyDickeyaspp.(syn.Erwiniachrysanthemi)inPoland.PlantPathology.2009,58:794.[2]TothIK,vanderWolfJM,SaddlerG,etal.Dickeyaspecies:anemergingproblemforpo-tatoproductioninEurope.PlantPathology.2011,60(3):385-399.[3]Tsror(Lahkim)L,ErlichO,LebiushS.,etal.AssessmentofrecentoutbreaksofDickeyasp.(syn.Erwiniachrysanthemi)slowwiltinpotatocropsinIsrael.Euro