GB∕T 43157-2023 石蒜绵粉蚧检疫鉴定方法（正式版）

石蒜绵粉蚧检疫鉴定方法2023-09-07发布国家市场监督管理总局I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。1石蒜绵粉蚧检疫鉴定方法1范围本文件描述了石蒜绵粉蚧(PhenacoccussolaniFerris)的现场检疫、形态鉴定和分子生物学鉴定方法。本文件适用于石蒜绵粉蚧的检疫和鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。着生在虫体背面成对出现的、如嘴唇状的横裂构造。注：又称背裂。通常为2对，少数种类只具1对。分为前背孔和后背孔。前背孔着生在前胸背板上，后背孔着生在第6腹节背板上。粉蚧科蚧虫的一种常分布于虫体背面边缘的特殊泌蜡结构。注：全称背缘刺孔群。从头部至腹部用“C数字”的形式表示。C₁~C₄分别代表头部4对[额对、触角对(又称眼前对)、眼对、眼后对]、C₅~C₁0分别代表胸部6对(每胸节各2对)、Cn～C18分别代表腹部8对(每腹节各1对)。少数种类背面中部也有分布，称背刺孔群。每个刺孔群一般有1对(少数1个或数个)锥状刺，锥刺附近聚集有三格腺或少数五格腺，以及数根附毛。位于虫体腹部腹面第3、第4腹节间，常以局部角质化的狭窄硬化框为界限，两侧常凹入，中间有节间褶横过。注：又称腹裂。腹脐的数目和大小在不同种类的蚧虫中变化很大。盘腺diskpores蚧虫体表呈盘状或多孔状的泌腺结构。2管腺tubularduct注：领状管(oral-collartubularduct),圆柱形，有不同的直径和长度，管口有一圈狭窄的硬化环包围。蕈腺(oral-rimtubularduct),圆柱形，在管筒的腺口外缘有一圈呈蘑菇状的角质突起。第8腹节肛环两侧的突出部分。注：尾瓣端部具1根长刚毛，称端毛。雌性生殖孔的开口。注：位于虫体腹面第7、第8腹节腹板之间，周围常有多格腺分布。4石蒜绵粉蚧的基本信息分类地位：半翅目(Hemiptera)、蚧总科(Coccoidea)、粉蚧科(Pseudococcidae)、绵粉蚧属(Phe-nacoccusFerris)绵粉蚧属世界已记录178种，其中与石蒜绵粉蚧(Phenacoccussolani)近似且为害较重的种类主要机械等媒介或载体传播扩散。各虫态可随寄主植物及其产品、栽培介质、包装和运输工具等调运及贸易等进行远距离传播。石蒜绵粉蚧的分布、寄主等其他基本信息见附录A。5方法原理依据该虫的生物学特性和为害状进行现场检疫，收集虫样。石蒜绵粉蚧的形态学鉴定以雌成虫的形态特征作为主要依据，取得雌成虫样本，制作成玻片标本，在生物显微镜下观察鉴定。石蒜绵粉蚧的分子生物学检测、鉴定，尤其是非成虫阶段虫样或残损成虫，可采用实时荧光PCR方法与近似种扶桑绵6器具和试剂3GB/T43157—20236.2试剂70%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、蒸馏水、甘油、乙醇-甘油保存液(70%乙醇和甘油的体积比为50:1)、10%氢氧化钠(或10%氢氧化钾)溶液、酸性品红溶液(酸性品红95%乙醇饱和溶液)、冰乙酸、酸性乙醇溶液(乙酸：95%乙醇：蒸馏水体积比为1:4.5:4.5)、二甲苯、苯酚、二甲苯苯酚溶液(二甲苯：苯酚体积比为3:1)、丁香油、中性树胶。昆虫基因组DNA提取试剂盒、双蒸水(ddH₂O)、液氮、提取液A[(1%十二烷基硫酸钠(SDS),50mmol/LTris·HCl(pH8.0),25mmol/L氯化钠，25mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)]、醋除另有规定外，所有试剂均为分析纯。7现场检疫检疫范围包括寄主植物的植株、繁殖材料及包装物、运输工具等载体。检查寄主植物的植株或繁殖材料的茎叶，植株是否长势衰弱，茎、叶是否有扭曲变形现象；借助放大镜检查植株的嫩叶、叶片、花芽、叶柄、花蕾和叶腋等处，是否有披覆白色蜡粉的虫体。石蒜绵粉蚧的危害状见附录A。检查包装物、铺垫材料、残留物，以及运载工具的箱体四壁、缝隙边角上是否有各虫态的石蒜绵粉蚧。如发现粉蚧，将虫样连同寄主一起取下，放入样品袋中，对发现的成虫也可用湿毛笔轻轻挑入装有70%乙醇的小离心管内(通常用1.5mL或2mL);对采集的虫样加以标记，做好现场记录，送实验室进行鉴定。8实验室鉴定8.1饲养对发现的疑似目标害虫的卵、若虫，可采取人工饲养方法在实验室培养，待其发育至成虫时再做形态鉴定。石蒜绵粉蚧的饲养方法见附录B。8.2玻片标本制作形态学鉴定以雌成虫玻片标本的显微形态特征为鉴定依据，石蒜绵粉蚧雌成虫玻片标本制作方法见附录C。8.3形态特征鉴定8.3.1绵粉蚧属(PhenacoccusCockerell)雌成虫鉴定特征绵粉蚧属雌成虫卵圆形或长形，两侧边几乎平行，体表覆有白蜡粉，体周缘有蜡丝。体节分明。产卵时能在体后分泌白色卵囊。触角常9节，少数8节或7节。眼发达。有前、后背裂。背孔2对，孔唇上一般具三格腺和小刺。腹脐多存在，在腹部第3、第4腹板间。肛环圆形，位于背末，具有1列～2列环孔和6根长环毛。足发达。爪下有齿。具盘腺，有多格腺、五格腺和三格腺；多格腺大多仅分布在虫体腹面，罕见分布于背面，在后一种情况下沿腹部背板的后缘形成横带或横列，有时则分布于头胸部，有时多格腺缺如；五格腺仅分布于虫体腹面或缺如；三格腺伴生在刚毛基部。4GB/T43157—2023具管状腺，分布于虫体背面与体腹面，全部管状腺的直径相同或几乎相同；领状管腺背腹面均有，背部管腺多大于腹部管腺，但有时两者等大。多格腺与管腺不组成腺管群。具刺孔群，1对～18对，一般具2根刺和少数三格腺；沿虫体背面体缘分布或仅在后面的腹节上。例外情况也有个别的额外刺孔群位于体背面中部。刺孔群不着生在高度硬化的瘤上。小刺在全部背面均有分布，有时还分布在体腹面边缘。8.3.2石蒜绵粉蚧(PhenacoccussolaniFerris)雌成虫鉴定特征8.3.2.1生态鉴别特征雌成虫、卵、若虫生态特征，通过体视显微镜观察描述。 雌成虫：椭圆形，体表的白色蜡粉厚实，体色变深，体缘蜡突明显，足呈深红色，体长0.9mm~1.2mm,体宽0.6mm左右。见附录D中图D.1。——卵：长椭圆形，黄色透明，长0.3mm～0.5mm,宽约0.14mm。——若虫：椭圆形，体表覆盖一层白色薄蜡粉，去除蜡粉后虫体呈黄色，足发达，共3龄。一龄若虫体长0.3mm～0.5mm,宽约0.18mm;复眼球形呈红棕色；二龄若虫体长为0.4mm~0.6mm,宽约0.3mm,体缘出现齿状突起；三龄若虫体长0.7mm～0.9mm,宽0.3mm~0.4mm,体缘突起明显，尾瓣突出，足的颜色加深。见附录D中图D.1。8.3.2.2玻片标本显微鉴定特征雌成虫玻片标本显微特征通过生物显微镜观察，见图D.2、图D.3,主要显微鉴定特征如下。——体阔椭圆形，长23.2mm～27.1mm,宽1.3mm～1.6mm。触角8节～9节，单眼发达，突出。足发达，各转节均由2个感觉孔，后足转节与腿节长之和为370μm～420μm,后足胫节与跗节之和为395μm～490μm,为跗节的2.2倍～2.5倍；其上具有许多透明孔。口器发达，下唇长127μm～140μm,稍短于唇基盾。腹脐椭圆形，位于第3腹节和第4腹节之间，三格腺若干。肛环周围有6根刚毛，每根长93μm～137μm。刺孔群18对。末对刺孔群有2根锥刺和10个～13个三格腺，其他刺孔群有2根锥刺和6个三格腺；末对刺孔群中刺较长。尾瓣发达。——背面：小刺散布。无多格腺，三格腺均匀分布，同时还分布有比三格腺小的单孔。——腹面：中部有长毛，小刺主要分布缘区，亦可延伸到中部。多格腺在第4腹节～第8腹节后缘中区排成一横列，第4腹节和第5腹节数量较少。五格腺无。三格腺均匀分布。管腺量少，主要分布于腹部第4节～第7节中区多格腺横列前面，2个～5个管腺在中胸口器和前气门后。8.3.3石蒜绵粉蚧与近似种的区别石蒜绵粉蚧常见近似种主要有扶桑绵粉蚧(P.solenopsis)、美地绵粉蚧(P.madeirensis)和木薯绵粉蚧(P.manihoti)等。石蒜绵粉蚧与常见近似种的鉴别检索表见附录E。8.4石蒜绵粉蚧分子生物学鉴定8.4.1蚧虫样本前处理、基因组DNA提取石蒜绵粉蚧样本的前处理和基因组DNA提取制备方法见附录F。8.4.2实时荧光PCR检测以石蒜绵粉蚧的DNA为阳性对照，以不含石蒜绵粉蚧的蚧虫DNA为阴性对照，同时以双蒸水代替模板DNA作为空白对照进行实时荧光PCR检测(见附录G)。59结果判定9.1形态学鉴定以雌成虫的形态特征为依据，符合8.3.2.2的描述可判定为石蒜绵粉蚧。该虫生态特征描述、其与常见近似种的鉴别检索表以及分布、寄主等生物学基本信息可作为参考。9.2实时荧光PCR检测在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，即阳性对照Ct值<35并出现典型扩增曲——检测样品的Ct值≤35时，判定为石蒜绵粉蚧；——检测样品无扩增曲线或Ct值>40时，判定为非石蒜绵粉蚧；——检测样品的35<Ct值≤40时，应重新进行测试。10标本保存雌成虫可制成玻片标本保存，卵、若虫和成虫均可用乙醇-甘油保存液保存。各类型标本均需记录6个月。6GB/T43157—2023(资料性)石蒜绵粉蚧其他基本信息A.1地理分布北美洲：加拿大(不列颠哥伦比亚省)、瓜德罗普(法)、危地马拉、夏威夷群岛(夏威夷)、墨西哥、安的列斯群岛(荷)(库拉索)、波多黎各和别克斯岛(波多黎各)美国(亚利桑那州、加利福尼亚州、科罗拉多州、佛罗里达州、路易斯安那州、马里兰州、新墨西哥州、俄勒冈州、得克萨斯州、弗吉尼亚州、华盛顿南美洲：巴西、哥伦比亚、古巴、厄瓜多尔、法属圭亚那、秘鲁、圣卢西亚、特立尼达和多巴哥(特立尼A.2寄主植物等31余科，喜食石蒜科、茄科、菊科等寄主。其常见寄主植物见表A.1。表A.1石蒜绵粉蚧主要寄主植物科名属名及种名爵床科Acanthaceae狗肝菜属Diclipterasp.,狭叶翠芦莉Ruelliasimplex番杏科AizoaceaeMesembryanthemumnodiflorum苋科Amaranthaceae密叶滨藜Atriplexconfertifolia,澳洲滨藜Atriplexsemibaccata,青箱属Csp.,青箱Celosiaargentea,藜属Chenopodiumsp.石蒜科Amaryllidaceae孤挺花属Amaryllissp.,油加律(亚马逊百合)Eucharisamazonica,朱顶红属Hippeastrumsp.,水鬼蕉Hymenocallislittoralis,石蒜Lycorisradiata,水仙属Narcissussp.,葱莲属Zephyranthessp.漆树科Anacardiaceae伞形科Apiaceae刺芹Eryngiumfoetidum天门冬科Asparagaceae天门冬属Asparagussp.,酒瓶兰属Beaucarneasp.,麦冬Ophiopogonjaponicus,杜宾虎眼万年青Ornithogalumdubium7科名属名及种名菊科Asteraceae著属Achilleasp.,紫茎泽兰Ageratinaadenophora,豚草属Ambrosiasp.,Ambrosiachamissonis,苦艾Artemisiaabsinthum,Artemisiadouglasiana,龙蒿Artemisiadracunculus,紫菀属Astersp.,铺散矢车菊Centaureadiffusa,Centaureadiluta,Centromadiaparryi,杭菊Chrysanthemummorifolium,白酒草属Conyeasp.,一点红Emiliasonchifolia,飞蓬属Erigeronsp.,Eriophyllumconfertiflorum,勋章菊Gazaniarigens,单冠菊属Haplopappussp.,向日葵属Heli-anthussp.,蝎尾蕉属Hemizoniasp.,异囊属Heterothecasp.,银胶菊Partheniumhysterophorus,苦苣菜Sonchusoleraceus,南美嘭棋菊Sphagneticolatrilobata,Tetradymiaspinosa,Verbesinasp.,孪花菊Wollastoniabiflora紫草科Boraginaceae钟穗花属Phaceliasp.,紫丹属Tournefortiasp.十字花科Brassicaceae甘蓝Brassicaoleracea,萝卜Raphanussativus仙人掌科Cactaceae仙人掌属Cactaceaesp.使君子科Combretaceae榄仁树Terminaliacatappa景天科Crassulaceae莲花掌属Aeoniumsp.,莲花掌Aeoniumarboreum,青锁龙属Crassulasp.,翡翠木Crassulaovata,石莲花属Echeveriasp.,银明色Echeveriacarnicolor,吴钩Echeveriacraigiana,罗西玛Echeverialongissima,摩莎Echeveriaracemosa,Echeveriarecurvata,施施莲Echeveriasessiliflora,厚叶草属Pachyphytumsp.,薄化妆Sedumpalmeri,观音莲Sempervivumtectorum莎草科Cyperaceae油莎草Cyperusesculentus,莎草Cyperusrotundus大戟科Euphorbiaceae大戟属Euphorbiasp,豆科FabaceaeAstragalusmiguelensis,羽扇豆属Lupinussp.,豇豆Vignaunguiculata草海桐科Goodeniaceae草海桐属Scaevolasp.鸢尾科Iridaceae鸢尾属Irissp唇形科Lamiaceae狼薄荷属Monardellasp锦葵科Malvaceae棉花Gossypiumhirsutum,木槿属Hibiscussp.,锦葵属Malvasp.,小花锦葵Malvaparviflora,Malvapusilla,Malvellaleprosa楝科Meliaceae苦楝Meliaazedarach兰科Orchidaceae石斛属Dendrobiumsp列当科OrobanchaceaeCastillejaapplegatei,列当属Orobanchesp.叶下珠科Phyllanthaceae苦味叶下珠Phyllanthusamarus禾本科Poaceae格兰马草属Boutelouasp.,香茅属Cymbopogonsp.,羊茅属Festucasp.,苇状羊茅Festucaarundinacea蓼科Polygonaceae多花绣毛蓼Eriogonumbellatum8表A.1石蒜绵粉蚧主要寄主植物(续)科名属名及种名马齿苋科Portulacaceae马齿苋属Portulacasp.,马齿苋Portulacaoleracea茜草科Rubiaceae小果咖啡Coffeaarabica芸香科Rutaceae柑橘属Citrussp.,青柠Citrusaurantiifolia茄科Solanaceae辣椒Capsicumannuum,夜香树Cestrumnocturnum,番茄属L.ycopersiconsp.,本氏烟草Nicotianabenthamiana,烟草Nicotianatabacum,酸浆属Physalissp.,Solanumdouglasii,番茄Solanumlycopersicum,金银茄Solanummelongena,马铃薯Solanumtuberosum马鞭草科Verbenaceae马缨丹Lantanacamara堇菜科Violaceae堇菜属Violasp.,三色堇Violatricolor葡萄科Vitaceae葡萄Vitisvinifera泽米铁科Zamiaceae非洲铁属Encephalartossp.,雨王非洲铁Encephalartostransvenosus姜科Zingiberaceae姜黄CurcumalongaA.3主要生物学特性该虫多营孤雌生殖，属于卵胎生，卵至成虫发育历期37d。卵产在卵囊内，每卵囊具卵150粒~600粒，且多数孵化为雌虫，卵期很短，1d内孵化为若虫，若虫期22d～25d,若虫3龄，1龄若虫历期约6d,行动活泼，从卵囊爬出后短时间内即可取食危害，取食位点不固定；2龄若虫需要8d,大多聚集在寄主植物的茎、花蕾和叶腋处取食；3龄若虫需要10d,虫体明显披覆白色蜡粉，营固定所取食。成虫整个虫体披覆白色蜡粉，似白色棉籽状群居于植物茎部，有时发现群居于寄主叶背。A.4危害石蒜绵粉蚧繁殖能力极强，单虫产卵量高，可营孤雌生殖，种群世代重叠，种群增长速度极快。以雌成虫和若虫吸食植物幼嫩部位的汁液，包括嫩枝、叶片、花芽和叶柄，造成受害植株长势衰弱，生长缓慢或停止，至失水干枯(见图A.1)。石蒜绵粉蚧还大量分泌蜜露，诱发煤污病，影响植株光合作用，导致被9图A.1石蒜绵粉蚧为害朱顶红(Hippeastrumsp.)(资料性)人工饲养石蒜绵粉蚧的方法B.1饲养寄主石蒜绵粉蚧若虫可用马铃薯、南瓜等进行人工饲养。马铃薯作为寄主植物时，选取健康、形状规则的块茎，置于干净的阴凉通风处，待其发芽，芽长大于0.5mm时即可用于饲养石蒜绵粉蚧；单头石蒜绵粉蚧可在1粒芽上进行吸食生存至生长发育完成，饲养期间马铃薯若不腐烂则无须更换。B.2饲养条件将寄主植物放置于大小合适的容器A(带透气网的养虫盒)中，挑取需饲养的石蒜绵粉蚧置于其马铃薯芽附近；将容器A放置于盛有水的容器B(可盛液体的盘状容器，高度不低于5cm)中，水中加适量洗涤剂，搅拌均匀后可产生细碎泡沫即可。将以上装置置于人工气候箱内，设定条件为：温度27℃士1℃,相对湿度70%±5%,光照12L:12D。B.3注意事项石蒜绵粉蚧属微小型昆虫，若虫可爬行，转移能力强；加之其寄主范围广泛，因此在进行室内饲养时，需警惕由容器密闭不到位或人员携带等原因造成的传播扩散。(资料性)石蒜绵粉蚧雌成虫玻片标本制作方法C.1标本固定挑取样品上的蚧虫置入70%乙醇中杀死固定2h,以备制作玻片标本。如需长期保存，则在70%乙醇中加入少量甘油(70%乙醇：甘油体积比为50:1)作为保存液。C.2脱脂净化选取经固定的成熟虫体，用解剖针(眼科手术刀)在虫体前端或侧面刺一小孔，若为较干燥的虫体，加热回软后再刺小孔，移入加有10%氢氧化钾(或10%氢氧化钠)溶液的小烧杯中，用数显加热板加热10min～30min,以不沸腾为度，直至体外蜡质和虫体内含物全部融化；将虫体移入盛有碱液的透明比色皿或其他器皿中，用昆虫解剖针、小毛笔等轻轻挤压、清理虫体，直至彻底清除内含物、虫体变为清洁透明。加热还可用水浴等方法，脱脂时间以标本透明为准。C.3漂洗/清洗把虫体从氢氧化钾溶液中移入热蒸馏水中浸泡、清洗，再移至酸乙醇溶液中5min,以清除和中和虫体表面和内部的碱液。移入酸性品红(酸性品红95%乙醇饱和溶液)中染色，也可用其他染料使虫体着色，染色时间视标本着色情况而定，一般5min～10min;移入95%乙醇中，视染色程度浸泡1min～3min,洗去浮色，但不能停留过久，以免褪色过度。用70%乙醇洗掉多余染色液，再依次经过95%乙醇、无水乙醇脱水各10min。C.6透明移入二甲苯苯酚溶液(二甲苯：苯酚体积比为3:1)内5min～10min进一步透明；移入二甲苯中1min～3min使颜色固定；移入橄榄油或丁香油中20min～30min或更长。C.7整姿封片在载玻片上加1滴中性树胶，移入虫体，用小毛笔整姿，用盖玻片封片。(资料性)石蒜绵粉蚧鉴定特征石蒜绵粉蚧成虫、若虫生态特征见图D.1,雌成虫玻片标本见图D.2,雌成虫显微形态特征见图D.2石蒜绵粉蚧(Phenacoccussolani)雌成虫玻片标本图(资料性)与常见近缘种的鉴别检索表1虫体表面无五格腺 2虫体腹面有五格腺 62无腹脐 3有腹脐 43触角6节 考氏绵粉蚧Phenacoccuskozari触角9节 侏儒绵粉蚧Phenacoccuspumilus4腹脐5个，以中间一个最大，盘形，位于第3与第4腹节腹板之间，其余4个分列其前后，依次减小 杏树绵粉蚧Phenacoccusprunicola腹脐1个 55多格腺于第4～第9腹节腹面中区后缘单横列，其中第4腹节与第5腹节较少，有时或无；第1～第5腹节腹面亚缘区无多格腺；腹脐小，横椭圆形；触角通常8节 石蒜绵粉蚧Phenacoccussolani多格腺分布于第6～第9腹节腹面中区，其中第6腹节后缘单横列，第7腹节之后成宽横带；第2～第6腹节腹面亚缘区各有数个多格腺；腹脐大，横椭圆形或纺锤形；触角通常9节 扶桑绵粉蚧Phenacoccussolenopsis6腹脐1个以上 7腹脐1个 87头胸部腹面有五格腺 花椒绵粉蚧Phenacoccusazaceae头胸部腹面无五格腺 槭树绵粉蚧Phenacoccusaceris8虫体背面无多格腺，多格腺仅分布于第4腹节及之后腹节腹面黄列，五格腺分布在腹面中区；管腺大小2种，大者分布于背面体缘及胸部腹面缘区，小者主要在各腹节腹面横列 马缨丹绵粉蚧Phenacoccusparvus虫体背面、腹面均有多格腺 99背面多格腺较少，仅腹部亚缘区少量；腹面主要分布各腹节。五格腺分布整个腹面，在唇基前有32个～68个。管腺大小2种。无背刺孔群 木薯绵粉蚧Phenacoccusmanihoti格腺在背面第4～第7腹节成行或带横列，缘区或亚缘区可向前延伸至第1腹节，有时在胸部缘区有个别，但胸部中区和亚中区通常无；在腹面各腹节上成行或带横列。管腺大小3种。有背刺孔群………美地绵粉蚧Phenacoccusmadeirensis(资料性)粉蚧分子检测样本前处理和基因组提取方法F.1蚧虫标本的前处理用于分子生物学试验的蚧虫样本使用前应长期冷藏在一4℃冰箱。所有蚧虫标本在DNA提取之前均要做前处理。前处理的方法为：蚧虫的卵、若虫、成虫或蚧虫残体标本用无菌水冲洗数遍，晾干；干标本、乙醇浸泡的标本用TE(pH8.0)浸泡处理1h～2h。F.2蚧虫基因组DNA提取F.2.1提取方法蚧虫基因组DNA提取一般采用试剂盒法或CTAB法。F.2.2试剂盒法将蚧虫样本移入1.5mL离心管中，捣碎或加入液氮碾磨，之后试验步骤根据昆虫基因组DNA提取试剂盒的操作说明书操作，蚧虫基因组DNA溶液置—20℃冷冻保存。F.2.3酚-三氯甲烷法将蚧虫样本移入1.5mL离心管中，加入40μL提取液A,放置于一70℃超低温冰箱中，20min后取出，用灭菌牙签或微量组织捣碎仪捣碎，匀浆，加入等体积的3mmol/L醋酸钾(pH7.2),冰上放置1h,加入等体积酚和三氯甲烷，混匀，12000g离心10min,取上清液，加入2倍体积冰冻100%乙醇混匀，放置冰箱1h沉淀DNA,12000g离心15min,弃上清液，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，12000g离心1min,晾干乙醇后用50μL～100μL双蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀，用微量分光光度仪测定DNA浓度和纯度后，将提取的基因组DNA于一20℃保存备用。F.3蚧虫DNA质量检查通过紫外分光光度计测定DNA溶液的OD值，DNA纯度=OD₂o/OD2s(OD2₀指核酸在260nm的吸光值，OD2%指蛋白质在280nm的吸光值)。DNA浓度=50×OD2oμg/mL。PCR级DNA溶液的OD₂与OD₃的比值应为1.6≤OD2so/OD2s≤2.0,比值低于1.6或高于2.0时模板纯度不够，前者不能满足PCR扩增时对模板的纯度要求，需用DNA快速纯化/回收试剂盒纯化；后者模板中含有RNA,需用RNA消化酶消化。(资料性)石蒜绵粉蚧实时荧光PCR检测G.1引物及探针实时荧光PCR引物及探针序列见表G.1。表G.1引物及探针序列引物/探针名称引物及探针序列PAS-F1上游引物：5'-TAGATTCTGACTTCTTTTACCTTCT-3'PAS-R1下游引物：5'-TTAAGGTAATAAAATTTTGATT-3'PAS-P探针：5'-FAM-ATACAGGTTGAACTTTATATCCTCCTT-BHQ1-3G.2反应体系实时荧光PCR反应体系见表G.2。使用具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪时，需按仪器要求添加ROX荧光试剂。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。试剂名称加入体积/μL2×TaqManreal-timePCRmastermix10μmol/L引物PAS-F110μmol/L引物PAS-R110ng/μL～100ng/μL模板DNAddH₂O补至20G.3反应程序/条件95℃预变性5min;95℃变性10s,58℃退火延伸30s,40个循环，每个循环结束后采集荧光信号。G.4阳性对照、阴性对照和空白对照的设置阳性对照：石蒜绵粉蚧的DNA或含有待测基因序列的质粒为PCR模板。阴性对照：不含石蒜绵粉蚧的蚧虫DNA为PCR模板。空白对照：双蒸水。各做2个重复。G.5PCR扩增产物的检测待测样品和阳性对照Ct值≤5,有典型的扩增曲线。阴性对照和空白对照无扩增曲线或Ct>40。如阳性对照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。Ct值>35的样品需调整模板浓度重新检测。[2]汤枋德.中国粉蚧科[M].北京：中国农业科技出版社，1992:6-10.[3]王珊珊，武三安.