植物组织培养六

第七章细胞培养

植物细胞培养（plantcellculture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术

根据培养规模:小规模培养和大批量培养；

根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；

根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。

12§1.单细胞分离

由完整的植物器官分离单细胞

由培养组织中分离单细胞

1、由完整的植物器官分离单细胞

叶片是分离单细胞的最好材料

机械法

酶解法

3撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞1-1、

机械法

第一种方法：用刀片刮叶片4第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心5只有薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

61-2、

酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心72、由培养组织分离单细胞

茎段步骤8摇床用于振荡继代悬浮(3)（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物15mlmedium/1g120rpmcultureTransfer1time/3d3weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心）isolation9注意：

选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。

选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、Pro、Gln。

继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。

10§2.细胞悬浮培养(cellsuspensionculture)

一、细胞悬浮培养的概念和意义

悬浮培养是将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。11Bioreactorforcontinuous

cellsuspensions

Shakerforsuspensionculture

Culturewheel

12

1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；

2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

13CellsuspensionPlantsArtificialseedsSecondaryproductsIsolationprotoplastsMutationselect细胞悬浮培养的应用14

三.细胞悬浮培养的方法

1、培养基

对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的培养基以原愈伤组织继代时的培养基除去琼脂为好。为了提高细胞的分散度，对于生长素和细胞分裂素的比例需要进行一些调节。

15

2、培养细胞的起始密度及细胞记数

（1）最低有效密度的概念

在悬浮细胞培养中，使悬浮培养细胞能够增殖的最少接种量称为最低有效密度或者临界的起始密度。

最低有效密度由于培养材料、原种培养条件，原种保存时间长短、培养基的成分不同而有差异，一般为104~105细胞/ml

16（2）细胞记数

要保证细胞培养的最低有效密度，在细胞游离后要对分离的单细胞进行记数，可用血球记数板。

（3）活细胞测定

除测定细胞密度外，尚需要测定活细胞率以作为测定起始密度的参考

活细胞率（%）=（5个视野中的活细胞数/5个视野中的细胞总数）×100%

17

活细胞测定的方法；

A、醋酸酯荧光素（FDA）染色法

FDA本身无荧光，无极性，可自由通过原生质体膜进入细胞内部，进入后由于受到活细胞内脂酶分解，而产生有荧光的极性物质荧光素，不能自由出入原生质体膜，在荧光显微镜下观察到的荧光是有活力的，反之无活力。具体操作：

取0.5ml细胞悬浮液放入到小试管中，加入FDA溶液，使最后浓度达到0.01%，混匀，室温下作用5min，荧光显微镜观察。

18B、酚藏红花染色法

先配制0.1%酚藏红花溶液，溶剂为培养液。检查时将悬浮细胞取一滴放在载玻片上，滴一滴0.1%酚藏红花，盖上盖玻片，染成红色的是死细胞，无色的是活细胞。

193、悬浮培养细胞数目的增殖变化

20细胞生长各个时期的特点：

滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关

对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变

直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期

缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少

静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。

21

讨论:

A、滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。

B、加入条件培养基可以缩短滞后期。

条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。

C、缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。

D、如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。

22操作注意事项：

对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-4细胞），使用吸管或注射器。

继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。

依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。

234、细胞生长的测定

对于任何一个建立的细胞悬浮系都应该进行动态的测定，以掌握其生长的基本规律，为继代培养或其他研究提供依据。

A、细胞记数

注意：由于悬浮培养的细胞并不会呈游离单细胞，因此通过培养瓶中直接取样很难进行可靠的细胞记数。可用5%~8%铬酸或0.25%的果胶酶对细胞团进行处理

生长速率p

P=（lnx-lnX0）/t

X为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度

24B、细胞大小的测定技术（用显微测微计）

C、细胞体积：将一定量的细胞悬浮液放入放入15ml刻度离心管中于2000g离心5min。以每毫升培养液中细胞体积的毫升数来表示。

D、细胞的干重和鲜重：将一定量的细胞悬浮液加到预先称重的尼龙布上，用水冲洗并抽滤除去细胞粘着的多余水滴，然后称重，两者差就是细胞的鲜重。干重一般是将离心收集的细胞转移到预先称重的滤纸片上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷却后称重。细胞的干重和鲜重一般以每毫升悬浮培养物的重量表示。

25E、有丝分裂指数

在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数称为有丝分裂指数，指数越高，分裂进行的速度越快。

一般用孚尔根染色法，先将组织用1molHCl在60℃水解后染色，常规镜检，统计500个细胞，计算。

265、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。27

6、影响悬浮细胞生长的因素：

起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。

接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。

培养条件：方式、温度、继代周期

28四、悬浮细胞的同步化

细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，工作中常用的处理方法：

1、物理方法

1）分选法

通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。

29悬浮液47μm膜过滤滤液31μm膜过滤收集

加入到10%~18%的Ficoll加入等体积的培养基网上细胞

180g离心5min收集各细胞层的细胞用培养基洗涤

分别接种

302）冷处理法：低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度

2、化学方法

1）饥饿法

悬浮培养细胞中，若断绝供应一种细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当在培养基中重新加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。

312）抑制剂法

通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。

常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。

3）有丝分裂阻抑

用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜

32无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。33

§3.单细胞培养技术

一、植物单细胞培养的意义

1、建立单细胞无性系

悬浮培养细胞间细胞间在遗传、生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。

2、排除体细胞的干扰

3、利于对细胞活动跟踪观察

34二、单细胞培养的方法

1、细胞平板培养

概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养

主要技术要点：

单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。

单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml

35植板：

将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。

36

植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。

植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞数)×100％

计算式中每个平板新形成的细胞团数的计数方法有两种：

一是直接计数法，注意计量时要掌握合适的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未长合到一起的时候。

二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计数。

37382、看护培养

概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。

39403、微室培养

概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。41特点：

（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程

（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。

424、其它单细胞培养技术

A饲养层培养基技术

将饲养细胞先用射线辐射处理，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞起到一个饲养作用。

B双层滤纸植板培养方法

培养基饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培养细胞43§4.植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产一.概述二.培养系统三.植物细胞规模培养技术要点四.提高细胞次生代谢产物的途径五.细胞规模化培养中的有关技术问题

44

一、概述

植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。所以把这一技术认为是植物细胞的“发酵工程”。A、有特殊的类似发酵工业反应器的生产系统和回收工艺。B、与植物的栽培不同，而与发酵工业相似，是独立众多的外界环境因素（包括天气、地理、季节、寄生物等）的生产过程。C、有较稳定的产品的质量和数量，可节省耕地，也可看作是一个“农作物”的储存库。451.植物产生代谢产物的类型

植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为：酚类化合物－黄酮类单酚类醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物－三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜、二萜含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱）胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白质氨基酸多炔类、有机酸等462．植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。

李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。

产品成分

用途

年销售额（亿美元）长春花碱（长春花）治疗白血病

18～20（美国）阿吗灵

循环系统障碍药

5～25（全世界）奎宁（金鸡纳树）

治疗疟疾

5～10（美国）致热素

杀虫剂20（全世界）毛地黄

心脏病药

20～55（美国）

47

许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。例如：

从胡萝卜、万寿菊提取色素

从黄菊提取芳香油

栀子提取果酸：果酸含有大量的维生素，如维生素C、柠檬酸等。主要用作食品的调味剂，化妆行业用于制作护肤品和洗发香波等，美容院用作换肤液。

483．规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径

保护生态环境

提高生产效率

发展新型生物技术产业

49生产方式

生产周期

紫草宁含量（％干重）

完整植株

2～3年

1～2

植物细胞培养3周14

来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较

50

4、植物细胞培养的特性

1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁．细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；

2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；

3）细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径达350mm一400mm的团块，悬浮培养较难；

4)培养时需供氧，培养液粘度大：

515)具有群体效应；

6)因为有细胞壁,培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；

7)细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；

8)悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（25000~50000个/ml）。

52

5、植物细胞培养需要解决的问题

（1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长；

（2）营养物的供应；

（3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化

（4）培养过程中细胞分化的防止，

（5）细胞培养中微生物的去除；

（6）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小；

53二.培养系统

1.悬浮培养系统

机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是根据植物细胞的特性在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式。因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。54机械搅拌式培养系统

55

气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。

56旋转式培养系统

一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。

57

2、固定化培养系统

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：

包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；

附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。

58平床培养系统。本系统由培养、液罐和动泵等构成。新鲜的细胞被固定在床底部由聚屏烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。

59

（2）立柱培养系统

本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个1-2cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液流经大部分细胞，亦即"滴液区"比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。

60这一技术的优点在于：

细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；

由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；

正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。

可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；61植物细胞固定化培养时必须考虑以下几个问题：①所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量是否很高，细胞生长速度是否较慢并能维持较长时间的生活能力；②所选用的固定支持物对细胞的存活是否有影响，对产物的合成是否有阻碍；③终产物是否能释放到培养基中，如果产物不释放到培养基中，是否能采用物理(电击)或化学(离子渗透法)方法使其释放而又不影响细胞生活力。62三.植物细胞规模培养技术要点1.细胞系的建立和选择

悬浮细胞系

单细胞养与筛选

种细胞增殖有效成分分析632.优良细胞系的增殖培养

所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。64

3.大规模培养体系的建立

一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。65四.提高细胞次生代谢产物的途径1．明确植物细胞生长与产物合成的关系生长偶联型产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；

中间型产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；

非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。662、选择适宜的起始材料

首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。

673、选择合适的培养基成分

一般来说，增加培养基的N，P、K的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。

684、前体

植物培养细胞具有能将有机化合物进行化学转化的巨大潜力，这些化学反应包括皂化、酯化、醛基化、羧基化、异构化、甲基化及双键还原等。因此可在培养基中加入适当的进行上述化学反应的前体，便有可能为我们得到需要的化学转达化目的产物。695、激发子的应用

植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。

激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。

A、非生物激发子，如辐射、金属离子等

B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。

706、培养技术的选择

包括对反应器的选择和对培养方式的选择，就目前的技术基础来讲，固定化培养是植物细胞规模化生产较为理想的系统

为了同时满足细胞生长和产物合成的需要，通常需要在不同阶段使用不同的培养基，即两阶段培养

为了解决产物对合成的反馈抑制可以采用两相培养技术，液-液系统：分离相常用的有液体石蜡、烷类化合物、甘油等液-固系统：常用的有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝、树脂等。

一般来说，提取相的选择目标是具有较大的分离能力，同时对于没有毒副作用，不影响产物的化学稳定性。

71五．植物细胞规模化培养中的有关工程技术问题

1．悬浮培养系统必须适应植物细胞特性2．植物细胞培养液的流变特性植物细胞培养液的流变特性常用粘度来描述培养过程中培养液的粘度变化可由细胞密度和细胞分泌物以及细胞状态引起。如烟草培养液的表观粘度培养过程中主要是由培养细胞密度的增加引起的，当细胞密度低于7gL-1时，培养液的粘度基本保持不变，而当细胞密度高于此值时，培养液的粘度即增加。长春花细胞培养，当细胞密度在10gL-1时，培养液属于假塑性流体，此时，培养液的粘度依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。在相同物质浓度下，大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培养液的表观粘度。

723．植物细胞培养过程中的气体调节O2：

KLa（体积氧传递系数，单位时间、单位体积氧量）：如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，KLa在20h-1左右时，细胞生长与次生产物合成均维持在良好状态；又如在15L的通风式反应器中培养的烟草细胞，当KLa值在5－10h-1的范围内，随着KLa的增加，生物量和代谢产物也呈线性增加。溶氧浓度：曾在不同氧浓度下对毛地黄细胞培养进行培养，结果显示，当培养基氧浓度从10%饱和度上升至30%时，细胞的生长速率从0.15