生物润滑油生物降解性测定法

1生物润滑油生物降解性测试法本文件规定了生物润滑油生物降解性的测定方法。本文件适用于对比评估生物润滑油在水中的生物降解性和标准参考材料的生物降解性。本方法不适用于水溶性或挥发性材料。2术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。3方法概要将含有矿物培养液（3.2.1）、试验油和接种物（3.2.3）的试验烧瓶与含有毒化样的烧瓶一起放置在培养箱中，培养时间为0d和21d。平行放置装有参比油（3.2.2）代替试验油的烧瓶。在培养期结束时，对烧瓶中的内容物进行酸化、声波振动并使用1,1,2-三氯三氟乙烷萃取。然后通过红外光谱分析提取物，测量在2930cm-1波长处CH2-CH3的C-H键的最大吸收峰值。吸收值用于计算毒化瓶和试验瓶的残余油含量，求出试验油的生物降解率。4仪器与材料4.1仪器4.1.1烧瓶：500mL，最小26口窄颈烧瓶，带玻璃塞。4.1.2干净棉花：用于在培养过程中塞住烧瓶口。4.1.3分液漏斗：500mL。每次重复试验单独使用一个漏斗。注1：试验前，必须彻底清洁所有玻璃器皿，且不含碳氢化合物。适合的清洗方法是使用洗涤剂清洗，用自来水彻底冲洗，然后用去离子水或蒸馏水彻底冲洗，最后用萃取溶剂冲洗后彻底干燥。（标准级二氯甲烷是可接受的交替冲洗溶剂）。水中应无碳氢化合物。注2：用于制备毒化样（6.1.4）的抗生素，可以吸附在玻璃器皿上。因此，为避免污染，建议每次连续运行时，对毒化样始终使用相同的烧瓶。2T/CPCIF0090—20214.1.4离心机：可选。低温离心机，最大离心力为4000g，运行10min。注3：高转速和高温可能会杀死细菌。4.1.5超声波振荡器：输出功率为100W-200W，频率为20kHz-40kHz。4.1.6恒温震荡培养箱：转速为120r/min-220r/min。4.1.7红外光谱仪：单光束或双光束。4.2材料4.2.1矿物培养液Mineralmedium矿物培养液的制备方法如下：将下述各种盐的混合物用去离子水或蒸馏水溶解并稀释至1L溶液，制备溶液A、B、C、D。(1)溶液A：8.50gKH2PO4，21.75gK2HPO4，33.40gNa2HPO4•2H2O，15.00gNH4Cl。(2)溶液B：22.50gMgSO4•7H2O。(3)溶液C：36.40gCaCl2•2H2O。(4)溶液D：0.75gH3BO3，3.00gFeSO4•7H2O，0.10gZnSO4•H2O，0.50gMnSO4•4H2O，0.05gCuSO4•5H2O，0.10gCoSO4，0.05g(NH4)6Mo7O24•4H2O。从A、B、C、D4种溶液中各取1mL，然后用蒸馏水或去离子水稀释成1L溶液得到矿物培养液。注5：水合化合物可由其他水合物或同等比例的无水材料代替。注6：溶液D在使用前必须摇匀，因为金属盐会析出并引起浑浊。溶液D应每6个月制备一次。4.2.2参比油4.2.2.1RFLP4.2.2.2RFDE注7：参比/标准油数据需满足表1中规定的质量。表1参比油3注8：可以通过以下方式获得参比油：天津内燃机研究所，150220820394.2.3接种物试验中使用的接种物的细菌水平应在104CFU/mL-107CFU/mL（CFU为菌落形成单位，ColonyFormingUnit）范围内。可通过使用以下接种物实现：（a）污水处理厂一级（机械）出水或（b）生活污水处理厂的二级（生物）出水。有必要，可将接种物浓缩。接种物应立即用粗糙的折叠滤纸过滤。如果不立即使用，则应在约6°C的温度下储存最多48h（包括收集时间）。可通过离心或膜过滤（最大孔径0.22μm）来调节粗滤接种物的浓度。必须用载玻片计数菌落。4.2.4萃取溶剂应使用光谱等级为1,1,2-三氯三氟乙烷（C2Cl3F3）。纯度应以十六烷为参照物，通过红外光谱（HC含量小于1μg/g）进行检查。4.2.5母液用萃取溶剂将15g待测润滑油配制成100mL试验油母液。用参比油配制类似的参比油母液。4.2.6控制油溶液在25mL萃取溶剂中加入50μL参比油母液配制成控制溶液。4.2.7盐酸水溶液c（HCl）=1mol/L。5试剂5.1青霉素钠：高纯。将7.00g青霉素钠溶于去离子水，定容至100mL，配成抗生素水溶液。5.2氯化钠：分析纯。警告：必须消除在红外光谱中具有2930±10cm-1的CH吸收峰的材料的污染。尤其是必须消除所有油脂和硅的来源。4T/CPCIF0090—20216试验步骤6.1准备试验样样品按可分为“0d样”和结束降解周期的“21d样”。6.1.1中性样：由150mL矿物培养液（见4.2.1）和1mL接种物组成；最少需要2个平行样,作为“0d样”。6.1.2试验油样：向中性样（见6.1.1）中加入50μL试验油母液（见4.2.5制备试验油样。“0d样”和“21d样”分别最少需要3个平行样。6.1.3参比油样：在中性样烧瓶中加入50μL参比油母液，制备参比油样。“0d样”和“21d样”分别最少需要3个平行样。6.1.4毒化样:在相应的试验油和参比油样瓶中添加抗生素水溶液（见5.1），但不加菌液。最少各需要2个平行样，作为“21d样”。6.2试验样的培养除用于测试“0d样”的烧瓶外，所有烧瓶均应用干净棉花塞住瓶口，在25℃±1℃的黑暗条件下，摇摆振荡培养21d，摇床转速120r/min~220r/min。试验开始后应准备“0d样”，0d中性样、0d试验油样在接种后立即萃取。6.3萃取培养期结束后，向试验烧瓶中加入30gNaCl、1mL1mol/LHCl溶液，并在超声波振荡器上超声振荡2min-3min，超声频率为20kHz-40kHz（输出100W–200W）、温度为20℃-25℃,通过摇动溶解盐。声波振动会使容器的内容物变热。在下一阶段进行前，应注意将其冷却至室温，使萃取剂不会蒸发过多。每个试验瓶中加入25mL萃取剂，用力摇晃1min–2min。随后，容器的内容物被转移到分离漏斗中，漏斗用塞子密封，不再进一步晃动。等待液体分层，然后移取出清亮的溶剂相（在分层界面没有任何的乳化液），并且直接转移到10mm×10mm的红外比色皿中。6.4红外光谱分析用红外分析仪测定萃取液的红外图谱，波数范围0cm-1-4000cm-1，采用基线法对红外图谱在2930cm-1±10cm-1处吸收峰的吸光度进行定量处理。7生物降解性的计算7.1红外光谱测定控制溶液的IR吸收率Ec，用于验证试验的有效性。7.2红外光谱测定中性样的IR吸收率，计算两个中性样吸收率的平均值En。7.3红外光谱测定试验油样、参比油样及其毒化样“0d样”液的IR吸收率E0。7.4计算E0与En之差，并计算算术平均值XE。7.5由式(1)计算变化系数(Cv),其中S为标准偏差。57.6红外光谱测定各“21d样”液的IR吸收率E，由式(2)计算各“21d样”液的残油含量。T或P=（E-En）/XE×100% （2）P和T分别为毒化样和测试油样中残油的平均质量分数，%7.7按式(3)计算生物降解率(B,%)。B=(P-T)/P×100% B是测试样生物降解率，%不活跃的接种物、不充分的实验室条件和不合适的试验材料可导致不正确的生物降解率值。因此，必须满足以下要求。8.1“0d样”的变化系数（Cv）必须<5%。如果没有，则必须报告数值并显示结果。8.2本试验要求参比油的XE须介于Ec的90%～110%之间，否则，整个试验运行无效。8.3用参比油获得的生物降解率必须在参考/标准油数据表中规定值的再现性范围内。如果参比油的值超出再现性范围，则整个试验运行无效。8.4参比油的中毒试验瓶21d后残油含量的平均值必须大于80%。否则，最终的测试运行无效。8.5试验材料中毒试验瓶21d后残余油含量的平均值必须大于80%，否则，试验方法不适用于测定试验材料的生物降解性。8.6每次测试必须测量参比油RFDE（3.2.2）9结果9.1结果必须以表格形式呈现，给出所附示例（表2）中概述的信息表2试验油的生物降解率//01------2------3------S------------1----2----32S---------