高效液相色谱分析法HPLC

关于高效液相色谱分析法HPLC§8.1概述Chromatography~利用当流动相带着混合组分在固定相间流动时，由于各组分在两相中有不同的吸附能力、溶解度或渗透性等特性，因而当两相作相对运动时，组分会在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异变大，移动速度不同，从而使混合组分得到分离Temporalcourse淋洗液慢中等快第2页,共78页，星期六，2024年，5月1.发展历史1906RussianbotanistTsweet经典液相色谱法toseparatethevariousplantspigments1941,MartinandSyngeLiquid-liquidpartitionchromatography1952，MartinandJamesGaschromatography60年代采用高压输液泵的高效液相色谱法70年代采用电导检测器的离子交换色谱法80年代末毛细管电泳分离法石油醚(mobilephase)CaCO3颗粒(stationaryphase)第3页,共78页，星期六，2024年，5月

Baseduponthephysicalstatusofthemobilephase

流动相

Gaschromatography（气相色谱法）:Gas-solidchromatography(气-固色谱法)~固定相为固体吸附剂

Gas-liquidchromatography(气-液色谱法)~固定相为涂在固体担体或毛细管内壁上的液体

Liquidchromatography（液相色谱法）:Liquid-solidchromatography(液-固色谱法)~固定相为固体吸附剂Liquid-liquidchromatography(液-液色谱法)~固定相为涂在固体担体上的液体Superficial-fluidchromatography(超临界流体色谱法)Mobilephaseisasubstanceattemperatureandpressureaboveitscriticalpoint2.ClassificationofChromatographicmethods第4页,共78页，星期六，2024年，5月液相色谱法分类类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析第5页,共78页，星期六，2024年，5月3.高效液相色谱法的特点特点：分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快应用：高沸点、大分子量、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析第6页,共78页，星期六，2024年，5月高效液相色谱法与经典液相色谱法比较

高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于：高速、高效、高灵敏度、高自动化第7页,共78页，星期六，2024年，5月高效液相色谱法与气相色谱法比较

分析对象GC：只限于分析气体和沸点较低的化合物（占有机物总数的20％）HPLC：可分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质（占有机物总数近80％）流动相GC：流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用HPLC：流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此流动相对分离起很大作用操作温度GC：一般都在较高温度下进行HPLC：通常在室温条件下工作第8页,共78页，星期六，2024年，5月4.高效液相色谱法的应用适于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质的分析在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析右图是各种HPLC方法的应用范围及对象分子量第9页,共78页，星期六，2024年，5月HPLC的局限性使用多种溶剂做流动相，成本高，污染大当使用梯度洗脱时，操作比GC的程序升温复杂缺少通用型的检测器不能替代毛细管GC去完成柱效高达10万块塔板以上的复杂体系的分离（如多沸程的石油产品）不能替代中、低压色谱，在200kPa~1MPa下去完成在高压下易分解、变形的具有生物活性的生化样品的分离第10页,共78页，星期六，2024年，5月§8.2

高效液相色谱仪HPLC仪器包括：高压输液装置(Deliverysystem)

进样系统(Injectionsystem)

分离系统(Separationsystem)

检测系统(Detectionsystem)(梯度淋洗、自动进样和数据处理装置)第11页,共78页，星期六，2024年，5月液相色谱仪WatersHPLC第12页,共78页，星期六，2024年，5月1.流动相贮存与脱气贮液罐一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相流动相输出端配0.45m膜过滤器，防止颗粒物进入泵内流动相脱气作用：防止在洗脱过程中，当流动相由色谱柱流入检测器时因压力降低而产生气泡消除溶解在流动相中的氧的影响氧会造成荧光猝灭还会使样品组分氧化或使固定相分解而导致柱分离性能改变第13页,共78页，星期六，2024年，5月脱气方法：真空泵抽滤脱气：单一溶剂低溶性惰性气体导入替换:氦气超声脱气在线真空脱气（On-linedegasser）实现流动相在进入高压泵前的连续在线脱气和过滤第14页,共78页，星期六，2024年，5月2.高压泵和梯度洗脱装置(1)高压输液泵压力：150～350×105

Pa作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统对输液泵的基本要求能在高压下连续工作流量准确可调0.1-10mL/min输出流量稳定耐腐蚀（耐酸不锈钢、PEEK聚醚醚酮）泵的死体积小（小于0.5mL）第15页,共78页，星期六，2024年，5月输液泵种类：恒压泵：可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但输出流量随色谱系统阻力变化而变化，现已较少使用恒流型：溶剂流量恒定，与柱填充情况无关机械注射式恒流泵机械往复式恒流泵：每分钟往复25~100次，脉动小第16页,共78页，星期六，2024年，5月(2)梯度洗脱装置梯度洗脱(GradientElutionorSolventProgramming):在样品分离过程中，按一定程序连续改变流动相中的两种或两种以上溶剂的比例，以改变流动相的极性、离子强度和pH等，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率，加快分离速度适用于组分分配比k相差很大的体系第17页,共78页，星期六，2024年，5月梯度洗脱类型:线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度阶梯梯度：直接从某一低强度流动相改变为另一较高强度流动相根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度（内梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱可获得任意形式的梯度，易于实现自动化溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积变化可能影响流动相的组成低压梯度（外梯度）:一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定比例抽入混合器中混合，然后由高压泵输送至色谱柱中消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化的影响可减小溶剂可压缩性的影响第18页,共78页，星期六，2024年，5月3.进样装置进样要求：将样品定量的、瞬间注入到色谱柱头填料中心，形成集中的一个点（柱塞式进样）进样装置:1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好3)自动进样器装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱第19页,共78页，星期六，2024年，5月4.色谱柱对色谱柱的要求：内壁光滑的直型不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小柱长多为10~30cm，内径为4~5mm尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大发展趋势是减小填料粒度以提高柱效柱外效应引起的峰形扩展不可忽视涡流扩散项He纵向扩散项Hd固定相传质阻力项Hs流动相迁移传质阻力项Hm流动相滞流传质阻力项Hsm第20页,共78页，星期六，2024年，5月柱的填充（Packing）：干法：粒度>20μm湿法（匀浆法）：粒度<20μm平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等填充方法：用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)第21页,共78页，星期六，2024年，5月5.液相色谱检测器溶质性检测器(SolutePropertyDetectors

)：只检测色谱柱后流出液中组分的物理、化学性质的变化紫外检测器

(UVAbsorbanceDetector

)荧光检测器

(FluorescenceDetector

)总体检测器

(BulkPropertyDetector

)：检测从色谱柱流出的流动相和组分总体物理性质的变化示差折光检测器

(DifferentialRefractometricDetector

)电导检测器

(ConductivityDetector

)第22页,共78页，星期六，2024年，5月5.液相色谱检测器

a.紫外检测器

检测原理：和UV-Vis方法一样应用最广：HPLC分析中，约80%的物质可以在254或280nm处产生紫外吸收采用微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1-10

L特点：

灵敏度高线形范围大波长可选，易于操作对流动相的流速和温度变化不敏感可用于梯度洗脱

石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液第23页,共78页，星期六，2024年，5月光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，可分别同时检测特定波长(180-600nm)10ms内完成一次检测计算机快速处理三维立体谱图第24页,共78页，星期六，2024年，5月快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图波长可的松氟美松皮质酮第25页,共78页，星期六，2024年，5月b.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）原理：通过连续测定参比池和测量池中溶液的折射率之差，来测定样品的浓度特点：通用型检测器（除紫外检测器之外应用最多的检测器）对温度敏感、不能用于梯度洗脱灵敏度低（10-7g/mL）偏转式、反射式和干涉型三种干涉式折光指数检测器造价高用的较少第26页,共78页，星期六，2024年，5月偏转式：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表与样品的浓度呈正比流通池体积大（10

L）可用于各种溶剂折射率的测定反射式折光指数检测器通过测定经流动相折射后反射光的强度变化，来测定组分的含量流通池体积小（3

L）用于不同溶剂折射率的测定时需更换流通池1.31-1.44和1.40-1.60第27页,共78页，星期六，2024年，5月c.荧光检测器（Fluorescencedetector）原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光特点：高灵敏度、高选择性所需样品量很小应用：多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等对部分不产生荧光的物质，可先衍生化在测定第28页,共78页，星期六，2024年，5月d）电导检测器原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量电导检测器的构成：

由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中不能用于梯度洗脱当pH>7时，该检测器不够灵敏电导检测器主要用于离子色谱的检测溶液至检测池电极

检测池第29页,共78页，星期六，2024年，5月e)蒸发激光散射检测器

（Evaporativelaserscatteringdetector,ELSD）原理：基于溶质的光散射性质属通用型和质量型检测器消除了溶剂干扰和温度变化引起的基线飘移可用于梯度洗脱适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测第30页,共78页，星期六，2024年，5月接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)f）安培检测器

由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5

L）组成原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测有电活性的物质第31页,共78页，星期六，2024年，5月§8.3主要分离类型与原理8.3.1液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph8.3.2液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph8.3.3离子交换色谱ion-exchangechromatograph8.3.4离子色谱ionchromatograph8.3.5离子对色谱ion-pairchromatograph8.3.6排阻色谱size-exclusionchromatograph8.3.7亲和色谱(AC)Affinitychromatograph第32页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.1

液-固吸附色谱

liquid-solidadsorption

chromatography固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等结构类型：全多孔型和薄壳型粒度：5～10μm流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸应用:

适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾第33页,共78页，星期六，2024年，5月

应用：环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。第34页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.2

液-液分配色谱

Liquid-liquidpartition

chromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）基本原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数流动相：为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）固定相：机械涂渍固定相化学键合固定相第35页,共78页，星期六，2024年，5月机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相全多孔型担体:

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料

表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）:

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶表面积小，柱容量底不足：固定液易流失分离稳定性及重现性差不适合梯度淋洗第36页,共78页，星期六，2024年，5月化学键合固定相通过化学反应将不同的有机官能团键合在载体表面Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定Octadecylsilane(ODS):十八烷基硅烷化键合相第37页,共78页，星期六，2024年，5月化学键合固定相的特点：传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定选择性好，可键合不同官能团，提高选择性有利于梯度洗脱分离机理：双重分离机制，键合基团的覆盖率决定分离机理高覆盖率：分配为主低覆盖率：吸附为主

第38页,共78页，星期六，2024年，5月例：稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器第39页,共78页，星期六，2024年，5月蛋白质的分析第40页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.3

离子交换色谱

ion-exchange

chromatography

固定相：阴离子交换树脂或阳离子交换树脂离子交换树脂：苯乙烯和二乙烯苯交联聚合而成固定离子基团＋可交换离子基团阳离子～：可交换离子基团带正电荷阴离子～：可交换离子基团带负电荷

流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液第41页,共78页，星期六，2024年，5月基本原理：基于离子交换树脂上的可交换离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间发生可逆交换，利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来分离阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：

分离无机离子和有机酸、有机碱等可离解的物质

生物物质的分离（如氨基酸、核酸、蛋白质等）第42页,共78页，星期六，2024年，5月离子交换分离机理ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－TemporalcourseＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋第43页,共78页，星期六，2024年，5月微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆1）多孔型（包括微孔型和大孔型）：聚苯乙烯+二乙烯苯交联交换基团多——交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2

m)

多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷1.离子交换色谱固定相3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子第44页,共78页，星期六，2024年，5月2.流动相：离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子强度)，通过改变以下条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，进而影响样品的分离。pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对—R+或—R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量L、组分X随流动相进入柱后，发生配位剂交换：

RM-L+X

RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类第45页,共78页，星期六，2024年，5月例：分离阴离子Column：IonPac

AG12A/AS12A

Eluent：2.7mMNa2CO3

0.3mMNaHCO3

Flowrate：1.2mL/minDetection：Conductivity

(ASRSRecyclemode)

0246810121416Retentiontime(min)08mSF-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-第46页,共78页，星期六，2024年，5月Column: IonPacCS12A,CG12AEluent: 20mMMethanesulfonicacidFlowrate: 1.0mL/minDetection: Conductivity

（CSRSRecyclemode)

例：分离阳离子02468101214Retentiontime(min)01234Na+NH4+K+Mg2+Ca2+µS第47页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.4离子色谱Ionchromatography

1975由H.Small

等首次提出,用于测定氯离子和硫酸根分离原理：与离子交换色谱原理一样与离子交换色谱的区别：采用特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂为柱填料采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导采用电导检测器离子色谱具有以下优点分析速度快

分离能力高分离混合阴离子的最有效方法耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱第48页,共78页，星期六，2024年，5月1.离子色谱装置类型抑制型：抑制柱型、连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱第49页,共78页，星期六，2024年，5月废液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity抑制器的作用:提高待测离子的电导率Na+,Cl-

H+,Cl-降低背景电导(淋洗液)Na+,HCO3-

H2CO3Na+,OH-

H2O第50页,共78页，星期六，2024年，5月极限摩尔电导值

Cation

＋－Anion

Ｈ＋Ｌｉ＋Ｎａ＋Ｋ＋ＮＨ４＋Ｍｇ２＋Ｃａ２＋３５０３９

５０７４７３５３６０ＯＨ－Ｆ－Ｃｌ－Ｂｒ－ＮＯ３－ＰＯ４３－ＳＯ４２－１９８５５７６７８７１８０８０Totalconductivity＝（）＋（）＋－（unit：μS/mequivalent）第51页,共78页，星期六，2024年，5月2.抑制器类型树脂填充的抑制柱：填充了带相反电荷离子交换树脂交换容量高、制备容易不能连续工作，抑制柱中的树脂需定期停机再生微膜抑制器自动再生连续抑制器

抑制柱上的交换反应第52页,共78页，星期六，2024年，5月微膜抑制器结构电极－电极＋离子交换膜离子交换膜流动相屏再生液屏再生液屏柱流出物至检测池废液

再生液第53页,共78页，星期六，2024年，5月

抑制器的工作原理(阴离子)Y+Na+X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子H2OH2OOH-Na+Y+H2ONa+Y+

X-

Na+CO32-(样品,淋洗液)H+H++CO32-H++X-

至检测器H2CO3H+X-H+

+O2H2OH2

+OH-H2ONa+OH-,H2H2O,O2废液废液电极（－）电极（＋）纯水或来自检测器的流体

H+H+H+H+阳离子交换膜阳离子交换膜第54页,共78页，星期六，2024年，5月

抑制器的工作原理(阳离子)H2OH2OH+

+O2H2OH2

+OH-H2O废液/气体废液H2OSO42-Y+

X-H+MSA-(样品e,淋洗液）OH-OH-MSA-SO42-X-OH-MSA-SO42-X-H+MSA-,O2H2O,H2H++OH-Y++OH-

H+

至检测器H2OY+OH-X-:

样品中的阴离子Y+:

样品中的阳离子电极（＋）电极（－）阴离子交换膜阴离子交换膜纯水或来自检测器的液体

第55页,共78页，星期六，2024年，5月微膜抑制器的优缺点优点：可以连续再生交换容量高死体积小（50

L以下）缺点：基体物质和溶剂对膜可能带来损害工作曲线线性范围受离子交换膜的影响第56页,共78页，星期六，2024年，5月新型连续自动再生柱抑制器

三根高容量、长寿命和易操作的微填充抑制柱。一根在流路工作一根用硫酸再生一根用水冲洗第57页,共78页，星期六，2024年，5月离子色谱的应用

例:阴离子分析双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm第58页,共78页，星期六，2024年，5月第59页,共78页，星期六，2024年，5月第60页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.5

离子对色谱ionpairchromatography

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+

X-后,在两相间分配主要用于分离分子量大的阴、阳离子脂肪酸、阴离子和阳离子表面化活性剂、烷基和芳香磺酸盐等第61页,共78页，星期六，2024年，5月反相离子对分离机理Mobilephase

TBAOH／ACN／H2OSampleY+X-

Ｈ２Ｏ

Ｈ２Ｏ固定相

TBA+OH-

Y+X-

Y+X-

(TBA+X-)

(TBA+X-)

(TBA+X-)

(TBA+X-)

TBA+OH-

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

TBA+OH-

TBA+OH-

疏水相

亲水相

Y+

OH-第62页,共78页，星期六，2024年，5月

Column: IonPacNS1、NG1Eluent: 2mMTBAOH, 24%～48%CANgradient in10minFlowrate: 1.0mL/min Detection: Conductivity(suppressortype)

（ASRSMPICMode）

Regenerator:10mNH2SO4

1.Methanesulfonicacid5.0μg/mL(ppm)

2.1-Propanesulfonicacid8.6

3.1-Butanesulfonicacid

8.7

4.1-Hexanesulfonicacid8.8

5.1-Heptanesulfonicacid8.9

6.1-Octanesulfonicacid8.9

7.1-Decanesulfonicacid9.10Retentiontime(min)12168µS0.0416234578.0反相离子对分离测定第63页,共78页，星期六，2024年，5月第64页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.6体积排阻色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶,具有一定大小孔隙分布软质凝胶:葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构水为流动相。适用于常压排阻分离半硬质凝胶:苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂硬质凝胶:多孔硅胶、多孔玻珠等化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用原理：按分子尺寸大小分离可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离第65页,共78页，星期六，2024年，5月凝胶色谱柱的总体积VA为：VA＝Vg＋

Vi＋V0Vg：填料骨架的体积Vi：填料孔体积V0：填料颗粒之间的体积A:排阻极限B:渗透极限凝胶色谱法的局限性：洗脱体积总是位于V0到Vi＋V0之间，因此凝胶色谱峰容量有限不能完全分离复杂的、多组分体系不能用于分子大小相似或分子量相差10％以内的组分的分离V0Vi第66页,共78页，星期六，2024年，5月凝胶色谱法在聚合物研究中的应用色谱柱：KF-80M(I.d.2cm,L60cm)流动相：四氢呋喃1ml/min柱前压：1.5Mpa常温检测器：UVD254nm第67页,共78页，星期六，2024年，5月8.3.7亲和色谱

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离固定相：将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等基质天然有机高聚物制成的凝胶，如琼脂糖、葡聚糖等合成有机聚合物形成的凝胶，如聚丙烯酰胺及其衍生物应用：主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备Lockandkeystructuralcomplex“锁匙结构络合物”第68页,共78