（高清版）GBT 41234-2022 水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范 假病毒

水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒2022-03-09发布国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、连云港海关、北京海关。1水生动物RNA病毒核酸检测参考物质质量控制规范假病毒本文件给出了作为水生动物RNA病毒核酸检测参考物质的假病毒，其质量控制规范的术语和定假病毒质量评价方法。本文件适用于水生动物RNA病毒核酸检测中假病毒(装甲RNA)类参考物质的质量控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。变异系数coefficientofvariation概率分布离散程度的一个归一化量度，其定义为数据标准差与数据平均值之比。初始样frontsample按照制备先后顺序，最先制备的1/3批次产品。外膜蛋白包裹病毒RNA片段形成的病毒样粒子。均匀性uniformity同一生产批次的假病毒，每支含有等量目的基因的状态。溯源性traceability假病毒中目的基因序列与病原参考毒株序列的一致性。稳定性stability假病毒在特定保存条件和保存时间范围内，保证检测结果为阳性的能力。2会得出理想的阳性检测结果，通常作为阳性对照判定待测样品是否为病原阳性。按照制备先后顺序，中间制备的1/3批次产品。按照制备先后顺序，最后制备的1/3批次产品。最小有效取样量minimumeffectivesamplevolume使用病原检测方法，可检测出阳性结果的最小阳性参考物质的量。4缩略语下列缩略语适用于本文件。Amp:氨苄青霉素(ampicillin)Ct:扩增循环数(cyclethreshold)cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dATP:三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(deoxyadenosinetriphosphate)dCTP:三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(deoxycytidinetriphosphate)dGTP:三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate)dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(deoxythymidinetriphosphate)EB:溴化乙锭(ethidiumbromide)LB:营养肉汤(luria-bertanibroth)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR:逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)RT-qPCR:逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reversetranscription-quantitativereal-timepol-ymerasechainreaction)假病毒为一种病毒样粒子，外膜蛋白为MS2噬菌体蛋白，包裹用于检测病毒的目的RNA片段。假病毒与MS2噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，且不具备自我复制能力和感染3假病毒表达载体含有MS2噬菌体的成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构(见附录A);在多克隆位点中插入病毒目的cDNA片段后形成重组假病毒表达载体；该载体在蛋白表达系统中能够将插入的外源片段转录成RNA,同时合成的MS2噬菌体蛋白能够选择性包裹RNA,自组装成病毒样粒子，成为假病毒。目前假病毒的制备方法主要为：先利用酶切连接法制备表达载体，再利用原核或真核表达系统组装假病毒粒子，制备流程按照附录B进行。作为RNA病毒检测参考物质的假病毒，应具备以下特征：包含有病毒RNA,可利用RT-PCR、RT-qPCR等核酸检测方法特异性检测到病毒RNA;具有良好的核酸酶耐受性，保护病毒目的RNA不被核酸酶降解；不含有病毒cDNA。6试剂或材料6.1本文件中所有化学试剂，除特别注明外，全部为分析纯试剂。6.4RT-PCR试剂和RT-qPCR试剂：商品化试剂。6.5病毒目的DNA的扩增引物：可参照相应的国家标准、行业标准合成。6.6Trizol:商品化试剂。6.7RNase:商品化试剂。6.9假病毒载体：由商品化载体构建。6.10制备假病毒所需的其他试剂：按照附录C配制。7仪器设备7.1超净工作台。7.2冷冻高速离心机。7.3电子天平。7.4高压灭菌锅。7.7荧光定量PCR仪。7.8紫外分光光度计。7.9凝胶成像系统。7.10移液器。8假病毒的质量控制8.1假病毒中病毒目的RNA片段的检测和溯源性8.1.1病毒目的RNA片段的RT-PCR检测以所制备的假病毒溶液作为待测样品，定性检测样品中是否含有病毒目的RNA片段。a)提取假病毒的RNA。b)以RNA为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行RT-PCR扩增。设置以4水为模板的阴性对照，以病毒RNA为模板的阳性对照。c)反应产物进行电泳观察。8.1.2扩增产物的溯源性分析将8.1.1的扩增产物回收、测序。测序结果与相应病毒参考毒株的序列进行比对。8.1.3假病毒中病毒目的RNA片段的质量判定在RT-PCR阴性对照和阳性对照都成立的情况下，若同时满足以下两点，则说明病毒目的RNA片段包裹入外膜蛋白：a)假病毒RNA的RT-PCR结果为阳性；b)扩增产物序列比对结果显示与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于99%。若假病毒RNART-PCR产物为阴性，则表明假病毒未包裹病毒目的RNA片段，或假病毒提纯失败，应重新制备假病毒或提纯假病毒。8.2假病毒中病毒cDNA杂质的检测分别以未抽提的假病毒溶液和抽提的假病毒RNA为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行PCR或qPCR扩增。设置以水为模板的阴性对照，以假病毒重组质粒为模板的阳性对照。8.2.2结果判定在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：a)未抽提的假病毒溶液或假病毒RNA,PCR或qPCR结果为阳性，则表明溶液或外膜蛋白中有病毒来源的cDNA杂质，则假病毒不能作为RNA参考物质使用，应重新消化去除cDNA;b)未抽提的假病毒溶液和假病毒RNA,PCR或qPCR结果为阴性，则说明病毒cDNA已全部去除。8.3假病毒中病毒目的RNA片段的定量使用RT-qPCR方法，对假病毒中病毒目的RNA片段进行定量。所使用的RT-qPCR方法应为针对该病毒目的RNA片段设计建立的方法。标准品可以为病毒RNA,或病毒cDNA,或含有病毒目的DNA片段的重组质粒，使用紫外分光光度计测定标准品浓度。将标准品10倍梯度稀释至少5个梯度，分别以每个梯度的标准品溶液为模板，进行RT-qPCR反应，根据各梯度标准品的Ct值和浓度制定标准曲线和公式。根据假病毒RNA的Ct值，利用标准曲线和公式计算出假病毒溶液中病毒目的RNA片段的浓度。也可以先计算假病毒RNA和标准品的Ct值的差，再根据公式(1)计算出假病毒RNA和标准品之间的浓度比、式中：△Ct——标准品Ct值和假病毒RNACt值的差；X——假病毒RNA和标准品之间的浓度比。58.4假病毒最小有效取样量的确证8.4.1.2分别提取6组假病毒的RNA。8.4.1.3以8.4.1.2为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件，进行RT-PCR或RT-qPCR扩增。设置以水为模板的阴性对照，以病毒RNA为模板的阳性对照。8.4.2最小有效取样量的确证在阴性对照和阳性对照都成立的情况下，样品扩增产物可同时满足以下三点要求的最小有效取样量：a)取样量可保证RNA提取过程正常完成；b)RT-PCR扩增出的目的DNA条带亮度不低于分子量标准(上样量5μL,浓度约50ng/μL)的条带亮度；c)RT-qPCR检测结果的Ct值介于25±3.3之间。8.5假病毒均匀性检测8.5.1.1以初始样、中间样、终止样三阶段分别随机抽取共10份假病毒样品。8.5.1.2依据同人同机原则，分别提取10份样品的RNA。8.5.1.3分别以10份假病毒RNA为模板，使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行RT-PCR或RT-qPCR扩增，每份样品做3个平行对照，取平均Ct值。8.5.1.4RT-PCR产物电泳，或RT-qPCR产物读数并计算变异系数。8.5.2假病毒均匀性判定判定标准如下：a)10份假病毒样品的检测结果全部为阳性，且RT-PCR扩增的10条DNA条带亮度相同；或RT-qPCR得出的10份样品Ct值变异系数≤10%,则表明假病毒样品均匀性良好；b)RT-PCR有样品为弱阳性或阴性；或RT-qPCR10份样品Ct值变异系数>10%,则表明假病毒样品均匀性不良，需重新混匀分装。8.6假病毒稳定性检测8.6.1假病毒温度稳定性检测设置2组假病毒样品，分别放置于4℃和-20℃保存。分别在第1天、第3天、第5天、第7天、第2周、第3周、第1月和第1年时间段，每组各取3支样品，1个样品应至少设三个重复，取500μL假病毒溶液提取RNA,使用相应病毒检测方法推荐的引物和实验条件进行检测。8.6.2假病毒RNase耐受性检测根据假病毒中病毒RNA的浓度，取假病毒溶液，含病毒RNA约10μg;加入100URNase,孵育1h,孵育温度根据RNase说明书设置。取500μL假病毒溶液提取RNA,进行RT-PCR或RT-qPCR6假病毒经以下3种方法平行处理后，RT-PCR或RT-qPCR检测结果仍为阳性，说明稳定性良好，否则需重新制备假病毒：a)4℃至少保存7d;b)-20℃至少保存1年；9假病毒的保存低于一20℃条件下保存时间不超过1年，避免反复冻融；4℃条件下保存时间不超过7d。假病毒作为水生动物RNA病毒核酸检测参考物质，经过至少5家具备核酸提取和分子生物学检测能力的水生动物检测实验室平行测定。测定内容包括病毒目的RNA片段的特异性、定性检测、定量检测等。定性检测要求检测结果为阳性，定量检测要求Ct值误差不超过±3.3。测定结果都合格后，才能投入使用。11假病毒质量评价方法经8.1～8.6步骤检测，假病毒应同时满足以下7点要求，才能作为水生动物RNA病毒核酸检测参考物质使用：a)外膜蛋白包裹病毒目的RNA片段，扩增片段序列与相应病毒的参考毒株序列同源性不低于99%;b)假病毒溶液中和外膜蛋白里都不含有病毒cDNA;c)最小有效取样量能同时满足RNA提取和RT-PCR或RT-qPCR的需求；d)同批次样品均匀性良好，检测结果基本一致；e)4℃保存7d,-20℃保存1年，检测结果仍为阳性；f)拥有一定的核酸酶耐受性，RNase处理1h后仍可使用；g)经过至少5家水生动物疫病研究实验室的平行测定，且测定结果全部合格。7(资料性)假病毒载体中插入的MS2基因(GenBankMK213795,成熟蛋白编码基因、衣壳蛋白编码基因和衣壳蛋白编码基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构),全长1706bp。1CTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTACCCTTGAT71AGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAGATAACTCATTCT141CTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGCCAAAACGAAACAGTGGCA211CTACCCCTCTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGT281GGGTCATCGTGGGGTCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACGCTCCTGCT351ACAGCCTCTTCCCTGTAAGCCAAAACTTGACTTACATCGA421GACCGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCAGGGTAATTTTAAC491ACAGCCTCACAACTCGCGACGCAAACCATTGCGCTCGTGA561GGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCTAAACGAAGATCG631GTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGT701AAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTAC771GCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTG841TTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTA911GAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGTTGTCGACTGGCTCCTAC981CCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGA1051TGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACT1121GGGGTACAATCCGTATGGCCAACAACTGGCGCGTACGTAA1191ATGCGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCTCTCTAGATAGAG1261AACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTG1331CTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTC1401TCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTC1471GGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACT1541CTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCA1611CTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACG1681TCGAAGACAACAAAGAAGTTCAATCTAGTGCCGCAGCTTGGTGTTGAGGCGTACACAAAGTTTCGAGATATCCAGGGTCAGGTCGGCAACATATCGGGTATCTTGACTGTAGGTAACGTAATAACGGCTAAGGCCCAGTCTCCTTTCCCTCAACCGGCGACGTGGCACAGGCTTACGAGGTGCCTATAAATATGGAAGGTCTCCTACCGGCCATTCAACGTTGCGACTTTAGCAGATGCCGCTCGTTCAAAACACGGTGCATATGATACTAACATCCGACGTATCGACCCACTAGGCATGCTCGAGGGTGAGTCCAAAATCTCAGCCTCGATGGTCGAGTTTGAAGTGTCGCCCCAAAAGTAACCTAAGTGGCAACACTAACCATTAAAGATGGAAAAACATGAGGACCGGGCGTCGGCCAGGTCGCGCGGTAATTTGGCCGGCAGGATGCTTACGAAGTTAGATGTGATATGGTTTATAGTGTGGGGCCTTACGGTCATAAGCGTCATGCATCGACATACCTTAGCATGGCTTCTAGCAACTTCGGTAGCGTTCGCCAGACTGTTCCAATTTTCGACCCGATTCCATTACCCATG8(规范性)假病毒制备方法B.1试剂或材料B.1.4假病毒质粒载体：由使用实验室自己合成，或采购其他实验室已经构建的载体。载体多克隆位点中应成功插入MS2蛋白基因片段，基因方向应正确，也可再插入6×His基因，使表达出的假病毒外膜蛋白包含6×His标签，可使用Ni-NTA亲和层析法纯化。B.1.7逆转录酶AMV:10U/μL,-20℃保存，避免反复冻融和温度剧烈变化。B.1.11IPTG:20%,按照C.1配制。B.2仪器设备B.2.1水浴锅。B.2.2恒温摇床。B.2.4冷冻高速离心机。B.2.5电子天平。B.2.7PCR仪。B.2.8电泳仪。B.2.9荧光定量PCR仪。B.2.10紫外分光光度计。9B.3.1病毒总RNA的提取按照待检目的病毒检测的国家标准或行业标准中推荐的方法，从病毒液中提取总RNA。对于还未建立检测标准的病毒，可按照非标方法提取总RNA。B.3.2目的cDNA的选择、引物设计和扩增B.3.2.1目的cDNA的选择：选择该病毒检测标准中推荐的目的DNA序列。位点的选择应遵循以下原则：a)应从假病毒载体上的酶切位点中选择；b)2条引物所带的酶切位点不能相同；c)应确保目的DNA不含有该酶切位点；d)确保引入酶切位点后，引物也不易产生发卡结构；e)两个酶切位点在载体上的位置，不能有重叠碱基。针对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒和草鱼呼肠孤病毒(I型和Ⅱ型)等重要水生动物RNA病毒，根据OIE水生动物疾病诊断手册和相关国家标准推荐的病毒目的DNA序列，可尝试使用以下酶切位点：正向引物，NotI或KpnI;反向引物，HindⅢ。应病毒检测标准进行。为增加DNA的回收量，RT-PCR的总反应体系至少为200μL。B.3.3反应产物的上样和电泳将50×TAE电泳缓冲液稀释50倍，再配制1%的琼脂糖(含0.5μg/mLEB)凝胶平板。将全部PCR扩增产物和1/5体积的上样缓冲液混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V/cm电泳20min～30min,当溴酚蓝到达凝胶平板2/3处时停止。在紫外灯下观察电泳后的凝胶，切下含目的DNA的条带，放入离心管中。根据商品化凝胶回收试取2μL目的DNA溶液上样和电泳，在紫外灯下观察电泳结果：若DNA分子量位置与检测标准中规定的目的DNA位置相同，则目的DNA回收成功；若位置不同，或无明显DNA条带出现，则目的DNA提取失败，应重新扩增回收。使用紫外分光光度计测量目的DNA浓度。根据分子量计算目的DNA和T载体的浓度，载体连接外源基因体系应符合表B.1要求。表B.1载体连接外源基因体系试剂加入量10×T4DNALigaseBuffer0.3pmolT载体0.03pmolT4DNA连接酶ddH₂O加水至总体积25μL反应条件：16℃,至少12h。100pg/mLAmp的LB平板(90mm直径)上；室温放置5min后，37℃倒置培养12h～16h。B.3.7.4培养结果观察：蓝色菌落携带空质粒，乳白色菌落携带重组质粒；若阴性对照也生长出菌落，说明培养基中Amp失效，需重新制备平板进行蓝白斑筛选。B.3.7.5将平板置于4℃保存备用，保存时间不超过1个月。B.3.7.6T载体重组质粒的提取：a)挑白斑单菌落，放入3mL含100pg/mLAmp的LB液体培养基中，37℃摇菌过夜。取1.5mL菌液4℃保存，保存时间不超过1个月。剩余1.5mL菌液用于提取T载体重组质粒。b)使用商品化质粒提取试剂盒提取菌液中的B.3.8T载体重组质粒和假病毒空载体的双酶切双酶切体系应符合表B.2要求。试剂加入量/μL质粒(T载体重组质粒或假病毒空载体)5'端内切酶23'端内切酶2Buffer5总体积50μL(酶切体系可根据商品化内切酶说明书进行调整)。酶切产物电泳，T载体重组质粒应当出现1条和空T载体大小相同的带，以及1条和病毒目的DNA大小相同的带；假病毒空质粒酶切后应当只出现1条DNA条带，大小与假病毒载体相同。按照B.3.4描述的方法，对酶切出的病毒cDNA和假病毒空载体DNA进行回收，并使用紫外分光光度计进行定量。将目的DNA连接入假病毒空载体，连接体系和反应条件见B.3.6。B.3.11假病毒连接产物的转化取消蓝白斑筛选步骤，其余步骤按照B.3.7的方法进行。最