细菌基因组DNA的提取-1

实验：细菌基因组DNA的提取制作人：蔡甘露（113516229）于妍（113516230）杨开莉（113516220）杜辉（113516222）主讲人：杜辉1精选2021版课件目录一、实验目的二、实验原理三、仪器、试剂四、实验方法和步骤五、实验注意事项六、DNA提取常见问题七、问题与讨论2精选2021版课件一、实验目的学会细菌基因组DNA的提取方法观察提取出来的DNA物质3精选2021版课件二、实验原理DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在，因此提取出脱氧核糖核蛋白复合物后，必须将其中蛋白质去除。在碱性条件下，用表面活性剂SDS将细菌细胞壁破裂，然后用高浓度的NaCl沉淀蛋白质杂质，经过氯仿抽提进一步去掉蛋白质等杂质，经乙醇沉淀，得到较纯的DNA。4精选2021版课件三、仪器、试剂1、仪器

离心管、离心机、试管、吸量管2、试剂（1）活材料：大肠杆菌（E.coli）或枯草杆菌（Bacillussubtilis）（2）培养基：LB液体培养基（3）溶菌酶：100μg/ml（4）裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L乙酸钠，1mol/LEDTA，1%SDS5精选2021版课件（5）1%SDS（十二烷基硫酸钠）：1gSDS溶于100ml蒸馏水，灭菌后-4℃保存（6）mol/LNaCl：称取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸馏水，灭菌后-4℃保存。（7）无水乙醇及70%乙醇（8）超纯水（9）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA-Na2（pH：8.0）（10）饱和酚（11）氯仿：异戊醇（25：1）6精选2021版课件四、实验方法和步骤1、DNA提取的一般方法破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中7精选2021版课件四、实验方法和步骤2、DNA提取的实验步骤菌体培养37℃、16—18h菌体收集12000r/min、30sNaCl充分混匀12000r/min，10min弃上清液200μL裂解缓冲液转移上清置新离心管加Tris饱和苯酚混匀12000rmin，3min取水层加氯仿混匀12000r/min、3min取上层清液加无水乙醇12000r/min、3min弃上清沉淀加400μL70%乙醇洗两次真空干燥溶解DNA-20℃冰箱8精选2021版课件五、实验注意事项1、材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。2、采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。3、离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。4、沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等。5、晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。9精选2021版课件1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2、DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3、DNA中残留有金属离子1、重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2、重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3、增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）六、DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应原因对策10精选2021版课件1、材料不新鲜或反复冻融2、未很好抑制内源核酸酶的活性3、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4、外源核酸酶污染5、反复冻融问题二：DNA降解对策

原因1、尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2、液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3、在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4、细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5、所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6、将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融11精选2021版课件1、简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因。

酚氯仿抽提DNA后，会使溶液分层，上层为水相，含有DNA；中间为蛋白（有时看不到）；下层为有机相。原因是酚氯仿可以使蛋白质变性，从而从溶液中析出，但是蛋白密度会小于酚氯仿，所以离心后它分布在中间；而DNA溶于水而不溶于有机相。2、沉淀ＤＮＡ时为什么要用无水乙醇？

是因为D